用于診斷肝素誘導(dǎo)性血小板減少癥的結(jié)合分析法制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及用于診斷肝素誘導(dǎo)性血小板減少癥的結(jié)合分析法，屬于體外診斷領(lǐng)域，并且具體涉及用于建立肝素誘導(dǎo)性血小板減少癥的易于自動化的結(jié)合分析法，該結(jié)合分析法使用了FcγRIIa蛋白涂覆的粒子。

Combination analysis for diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia

The invention relates to a binding analysis method for the diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia, which belongs to the field of in vitro diagnosis, and in particular to an easily automated binding analysis method for the establishment of heparin-induced thrombocytopenia. The binding analysis method uses particles coated with Fc gamma RIIa protein.

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
用于診斷肝素誘導(dǎo)性血小板減少癥的結(jié)合分析法
本專利技術(shù)屬于體外診斷領(lǐng)域，并且涉及用于確定肝素誘導(dǎo)性血小板減少癥的易于自動化的結(jié)合分析法，該結(jié)合分析法使用涂覆有FcγRIIa蛋白的粒子。
技術(shù)介紹
肝素誘導(dǎo)性血小板減少癥(HIT)是一種血栓形成障礙癥，其可能在肝素治療期間出現(xiàn)，并可能導(dǎo)致危及生命的血栓栓塞并發(fā)癥。受影響的患者產(chǎn)生結(jié)合由肝素和血小板因子4(PF4)構(gòu)成的復(fù)合物的抗體，所謂的抗PF4/肝素復(fù)合物抗體。在體內(nèi)，抗體結(jié)合的PF4/肝素復(fù)合物與凝血細(xì)胞(thrombocyte)表面結(jié)合并導(dǎo)致凝血細(xì)胞活化。這會導(dǎo)致凝血細(xì)胞計數(shù)減少和血栓栓塞風(fēng)險增加。兩種分析原理主要用于HIT診斷。第一種分析原理基于來自患者的體液樣品中的抗PF4/肝素復(fù)合物抗體的直接檢測。為此，將樣品與PF4/肝素復(fù)合物或由PF4和另一種合適的聚陰離子(如，例如，聚乙烯磺酸鹽)構(gòu)成的復(fù)合物接觸，使用常規(guī)免疫學(xué)分析方法(例如，ELISA)測量樣品中存在的任何抗-PF4/肝素復(fù)合物抗體的結(jié)合。然而，缺點在于，雖然抗PF4/肝素復(fù)合物抗體的檢測是靈敏的，但它不是完全特異性的，即抗體的檢測不足以用于陽性HIT診斷，而陰性結(jié)果會適當(dāng)可靠地排除HIT。因此，推薦通過基于第二分析原理的功能性分析法進(jìn)行確證。第二功能性分析原理基于抗PF4/肝素復(fù)合物抗體的凝血細(xì)胞活化作用的檢測。在所述分析原理中，將來自一個或多個正常供體的經(jīng)洗滌的凝血細(xì)胞與來自患者的血漿或血清樣品和肝素混合，并且基于已知的活化標(biāo)記如例如基于釋放血清素(serotonin)的量(5-羥色胺釋放分析法)，或基于凝血細(xì)胞的可視覺識別的凝集反應(yīng)(HIPA分析法)測量凝血細(xì)胞活化作用。如果患者樣品含有抗PF4/肝素復(fù)合物抗體，則有可能確定與正常樣品(無此類抗體)相比升高的凝血細(xì)胞活化作用。基于凝血細(xì)胞的功能性分析法具有的缺點是凝血細(xì)胞必須在復(fù)雜的手工方法中制備，并且由于其保質(zhì)期不充分而只能使用新鮮的凝血細(xì)胞。另外，總是需要使用來自多個供體的凝血細(xì)胞的混合物，才能補(bǔ)償各個血凝血細(xì)胞制劑之間的生物學(xué)差異，由此允許一定的標(biāo)準(zhǔn)化。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的一個目的是提供一種用于檢測體液樣品中抗PF4/肝素復(fù)合物抗體的方法，該方法避免了上述缺點，特別是凝血細(xì)胞的使用。據(jù)發(fā)現(xiàn)，在通過將樣品與肝素或PF4/肝素復(fù)合物和顆粒固相混合并測量顆粒固相的凝集的反應(yīng)混合物中，當(dāng)顆粒固相涂覆有分離的FcγRIIa蛋白時能夠確定抗-PF4/肝素復(fù)合物抗體在樣品中的存在。因此，本專利技術(shù)提供了一種用于檢測體液樣品中抗-PF4/肝素復(fù)合物抗體的方法。該方法包括以下步驟：i.通過將樣品與以下物質(zhì)混合而提供反應(yīng)混合物：·肝素或PF4結(jié)合的無支鏈多糖或PF4結(jié)合的聚陰離子，或·PF4/肝素復(fù)合物或由PF4與無支鏈多糖或聚陰離子構(gòu)成的復(fù)合物，和·顆粒固相；ii.測量反應(yīng)混合物中顆粒固相的凝集；iii.將由此測量的反應(yīng)混合物中的凝集與含有來自已知不含抗-PF4/肝素復(fù)合物抗體的供體的體液樣品的反應(yīng)混合物中的凝集的預(yù)定參考值進(jìn)行比較；和iv.當(dāng)反應(yīng)混合物中測定的凝集超過參考值時，確定樣品中抗PF4/肝素復(fù)合物抗體的存在，其中顆粒固相涂覆有分離的FcγRIIa蛋白。體液樣品優(yōu)選來源于人。優(yōu)選地，體液樣品是基本上不含凝血細(xì)胞并且具體而言是血漿或血清的樣品。體液樣品能夠與PF4結(jié)合的無支鏈多糖或與PF4結(jié)合的聚陰離子混合。與PF4形成的多種PF4-結(jié)合物質(zhì)，通過要檢測的抗-PF4/肝素復(fù)合物抗體結(jié)合的復(fù)合物，是已知的。合適的無支鏈多糖是例如肝素、未分級肝素(UFH)、分級肝素(LMWH)、硫酸葡聚糖和巖藻依聚糖(fucoidan)。合適的聚陰離子是例如聚乙烯硫酸鹽、聚乙烯磺酸鹽、聚乙烯磷酸鹽、聚乙烯膦酸鹽、聚苯乙烯硫酸鹽和聚苯乙烯磺酸鹽。可替換地，體液樣品能夠與PF4/肝素復(fù)合物或與由PF4與無支鏈多糖或聚陰離子構(gòu)成的復(fù)合物混合。此外，樣品與涂覆有分離的FcγRIIa蛋白的顆粒固相混合。在本專利技術(shù)的上下文中，術(shù)語“顆粒固相”應(yīng)該理解為意指近似直徑為至少20nm且不大于20μm，通常200nm至350nm，優(yōu)選250nm至320nm，特別優(yōu)選270nm至290nm，非常特別優(yōu)選280nm的非細(xì)胞顆粒。微粒可以是規(guī)則或不規(guī)則的形狀。它們可以是球體(sphere)、橢球體(spheroid)、具有或多或少的大空腔或孔道的球體。微粒能夠由有機(jī)材料、無機(jī)材料或二者的混合物或組合而構(gòu)成。它們能夠由多孔或無孔的、可膨脹或不可膨脹的材料構(gòu)成。原則上，微粒能夠具有任何密度，但優(yōu)選密度接近水密度的粒子，如約0.7～約1.5g/ml。優(yōu)選的微粒可懸浮于水溶液中并且盡可能長時間懸浮穩(wěn)定。它們可以是透明的、部分透明的或不透明的。微粒能夠由多個層構(gòu)成如例如，包含芯和一個或多個包封層的所謂“核-殼”粒子。術(shù)語微粒涵蓋例如染料晶體、金屬溶膠、二氧化硅粒子、玻璃粒子和磁性粒子。優(yōu)選的微粒是可懸浮于水溶液中并由水不溶性聚合物材料構(gòu)成的粒子，具體而言是由取代的聚乙烯構(gòu)成的粒子。非常特別優(yōu)選的是乳膠粒子，例如，由聚苯乙烯、丙烯酸聚合物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯腈聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚乙酸乙烯酯丙烯酸酯、聚乙烯吡啶、氯乙烯丙烯酸酯構(gòu)成的乳膠粒子。特別感興趣的是在其表面上具有反應(yīng)性基團(tuán)如例如羧基、氨基或醛基的乳膠粒子，該反應(yīng)性基團(tuán)允許分離的FcγRIIa蛋白與乳膠粒子共價結(jié)合。在本專利技術(shù)的上下文中，術(shù)語“微粒固相”明確不涵蓋人、動物、植物或真菌細(xì)胞或細(xì)菌。術(shù)語“分離的FcγRIIa蛋白”應(yīng)理解為是指重組或合成產(chǎn)生的FcγRIIa蛋白或天然FcγRIIa蛋白，即來自天然來源，例如，由人類白細(xì)胞純化的蛋白。適用于生產(chǎn)重組FcγRIIa蛋白的是已知的原核或真核表達(dá)系統(tǒng)，如例如，在細(xì)菌(例如，大腸桿菌)中，在酵母(例如，釀酒酵母，巴斯德畢赤酵母)中，在植物、動物或人細(xì)胞培養(yǎng)物中的表達(dá)。適用于合成FcγRIIa蛋白的生產(chǎn)是用于體外蛋白合成的已知技術(shù)，例如，固相合成(例如，梅里菲爾德合成)。優(yōu)選地，在根據(jù)本專利技術(shù)的方法中使用的FcγRIIa蛋白是重組產(chǎn)生的FcγRIIa蛋白，其產(chǎn)生于人類細(xì)胞的培養(yǎng)物中，優(yōu)選人類胚胎腎細(xì)胞(HEK細(xì)胞)的培養(yǎng)物中。FcγRIIa蛋白(同義詞：CD32a蛋白)優(yōu)選是人FcγRIIa蛋白。術(shù)語“FcγRIIa蛋白”不僅涵蓋完整的FcγRIIa蛋白，而且還涵蓋能夠結(jié)合至由PF4/肝素復(fù)合物和由其結(jié)合的抗PF4/肝素復(fù)合物抗體組成的免疫復(fù)合物的完整FcγRIIa蛋白的片段。術(shù)語“FcγRIIa蛋白”進(jìn)一步不僅涵蓋野生型FcγRIIa蛋白或其片段，而且還涵蓋具有一個或多個能夠結(jié)合PF4/肝素復(fù)合物的氨基酸取代基如例如人FcγRIIa蛋白的位置131處的已知取代的FcγRIIa蛋白。FcγRIIa蛋白或FcγRIIa蛋白片段能夠在N-端與異源信號序列融合，即與通常不存在于人FcγRIIa蛋白中卻在所選擇的表達(dá)系統(tǒng)中對重組表達(dá)的FcγRIIa蛋白的表達(dá)和/或分泌產(chǎn)生積極影響的多肽融合。此外，F(xiàn)cγRIIa蛋白或FcγRIIa蛋白片段能夠在C端與一個或多個允許將例如重組表達(dá)的蛋白結(jié)合于親和支持物的親和標(biāo)簽融合，允許例如重組表達(dá)的FcγRIIa蛋白的純化。優(yōu)選的是長度不超過12個氨本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
1.一種用于檢測體液樣品中抗PF4/肝素復(fù)合物抗體的方法，所述方法包括以下步驟：i.通過將所述樣品與以下物質(zhì)混合提供反應(yīng)混合物：·肝素或PF4結(jié)合的無支鏈多糖或PF4結(jié)合的聚陰離子，或·PF4/肝素復(fù)合物或由PF4與無支鏈多糖或聚陰離子構(gòu)成的復(fù)合物，和·顆粒固相；以及ii.測量所述反應(yīng)混合物中所述顆粒固相的凝集；iii.將由此測量的所述反應(yīng)混合物中的凝集與含有來自已知不含抗PF4/肝素復(fù)合物抗體的供體體液樣品的反應(yīng)混合物中的凝集的預(yù)定參考值進(jìn)行比較；和iv.當(dāng)所述反應(yīng)混合物中測定的凝集超過所述參考值時，確定所述樣品中抗PF4/肝素復(fù)合物抗體的存在，其特征在于，所述顆粒固相涂覆有分離的FcγRIIa蛋白。

【技術(shù)特征摘要】
2017.08.02 EP 17184389.91.一種用于檢測體液樣品中抗PF4/肝素復(fù)合物抗體的方法，所述方法包括以下步驟：i.通過將所述樣品與以下物質(zhì)混合提供反應(yīng)混合物：·肝素或PF4結(jié)合的無支鏈多糖或PF4結(jié)合的聚陰離子，或·PF4/肝素復(fù)合物或由PF4與無支鏈多糖或聚陰離子構(gòu)成的復(fù)合物，和·顆粒固相；以及ii.測量所述反應(yīng)混合物中所述顆粒固相的凝集；iii.將由此測量的所述反應(yīng)混合物中的凝集與含有來自已知不含抗PF4/肝素復(fù)合物抗體的供體體液樣品的反應(yīng)混合物中的凝集的預(yù)定參考值進(jìn)行比較；和iv.當(dāng)所述反應(yīng)混合物中測定的凝集超過所述參考值時，確定所述樣品中抗PF4/肝素復(fù)合物抗體的存在，其特征在于，所述顆粒固相涂覆有分離的FcγRIIa蛋白。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中光度測量所述反應(yīng)混合物中所述顆粒固相的凝集。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述顆粒固相的第一部分與信號形成系統(tǒng)的第一組分結(jié)合，以及所述顆粒固相的第二部分與所述信號形成系統(tǒng)的第二組分結(jié)合，并且其中所述信號形成系統(tǒng)的所述第一組分和所述第二組分相互作用，使得在所述信號形成系統(tǒng)的所述第一組分和所述第二組分彼此緊密靠近時形成可檢測信號，并且基于所形成的信號測量所述反應(yīng)混合物中所述顆粒固相的凝集。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述信號形成系統(tǒng)的所述第一組分是化學(xué)發(fā)光劑以及所述信號形成系統(tǒng)的所述第二組分是光敏劑，反之亦然，并且其中測量所述反應(yīng)混合物...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：哈拉爾德·阿爾特豪斯，赫伯特·施瓦茨，諾貝特·桑德爾，
申請(專利權(quán))人：西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限責(zé)任公司，
類型：發(fā)明
國別省市：德國,DE