一種針對(duì)KRAS基因突變檢測(cè)的試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提出了一種新的針對(duì)KRAS基因突變檢測(cè)的試劑盒，運(yùn)用了雙相酶系統(tǒng)RNase?H2和DNA聚合酶技術(shù)，由于采用的是雙酶系統(tǒng)擴(kuò)增法，在普通引物的基礎(chǔ)上有所改變，即在引物序列SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.7的3'端連接有間隔臂x，這樣使引物能夠特異地與模板序列結(jié)合，并在RNase?H2剪切后能特異擴(kuò)增；設(shè)計(jì)了針對(duì)KRAS基因突變位點(diǎn)的引物探針，采用熒光PCR，封閉式檢測(cè)，減少了后期污染的可能性；本發(fā)明專利技術(shù)提供的試劑盒的敏感度高，檢測(cè)快速，穩(wěn)定性好，封閉式檢測(cè)，減少了后期污染的可能性。

A Kit for Detecting KRAS Gene Mutation

The present invention proposes a new kit for KRAS gene mutation detection, which uses two-phase enzyme system RNase H2 and DNA polymerase technology. Due to the use of double-enzyme system amplification method, it has been changed on the basis of common primers, i.e., the 3'end of primer sequence SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.7 is connected with spacer arm x, so that primers can specifically bind with template sequence, and After RNase H2 shearing, it can amplify specifically; a primer probe for mutation site of KRAS gene is designed, which uses fluorescent PCR and closed detection to reduce the possibility of late contamination; the kit provided by the invention has high sensitivity, fast detection, good stability, closed detection, and reduces the possibility of late contamination.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種針對(duì)KRAS基因突變檢測(cè)的試劑盒
本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)
，具體涉及一種針對(duì)KRAS基因突變進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒。
技術(shù)介紹
KRAS屬于Ras基因家族主要成員之一，位于EGFR信號(hào)通路的下游。KRAS編碼P21蛋白，在MAPK信號(hào)通路中起作用，是一種致癌基因，能夠與GDP/GTP結(jié)合并促進(jìn)GTP酶活性。當(dāng)KRAS發(fā)生突變時(shí)不能被水解酶水解失活，并處于持續(xù)激活狀態(tài)，可以引起RAF/MAPK的上調(diào)，傳遞多種生存通路信號(hào)，從而使細(xì)胞過度生長(zhǎng)、增殖，抑制EGFR-TKIs的作用。17％到25％人類腫瘤中存在KRAS基因的突變，其突變可以導(dǎo)致多種惡性腫瘤，包括胰腺(95％)，甲狀腺(55％)，大腸癌(35％)，肺癌(35％)等。KRAS基因被激活最常見的方式是點(diǎn)突變，多發(fā)生在N端的第12、13和61、146密碼子，其中以第12密碼子突變最常見。Ras家族基因在癌癥中沒有可用的藥物直接拮抗此靶點(diǎn)，主要影響信號(hào)通路上下游靶點(diǎn)藥物的使用效果，突變主要導(dǎo)致EGFR靶向藥，BRAF靶向藥的耐藥性等。全球結(jié)直腸癌每年新發(fā)病例數(shù)約120萬，年病死人數(shù)超過60萬，發(fā)病率居第4位。近些年，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。早在2009年，美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ASCO)即建議對(duì)于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，在選擇抗EGFR的單抗藥物(西妥昔單抗或帕尼單抗)治療前應(yīng)檢測(cè)KRAS基因狀態(tài)。多個(gè)大樣本、多中心III期臨床研究結(jié)果提示，KRAS基因第2號(hào)外顯子第12、13位密碼子的突變狀態(tài)與阻斷EGFR的單克隆抗體——西妥昔單抗、帕尼單抗的療效明確相關(guān)，KRAS野生型的患者可以從西妥昔單抗和帕尼單抗的治療中獲得最大化的生存效益。KRAS基因突變發(fā)生在大約30％的肺腺癌中。肺癌KRAS突變主要定位在第12和13號(hào)密碼子。同時(shí)，肺癌中的KRAS突變似乎與EGFR和ALK易位互不相容，眾多研究顯示，KRAS基因突變是影響TKI藥物療效的不利因素。此外，也有研究表明，KRAS突變患者通常都有吸煙史。雖然KRAS的發(fā)現(xiàn)比EGFR早二十多年，但由于研發(fā)難度大，目前針對(duì)KRAS的靶向藥物少之又少。2013年《NCCN非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南》明確指出：腫瘤患者接受EGFR靶向藥物治療之前，必須進(jìn)行RAS基因突變檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果決定是否使用EGFRTKI靶向藥物作為臨床治療措施。新的指南規(guī)定，RAS基因如果發(fā)生了突變，則不建議病人使用EGFRTKI進(jìn)行分子靶向治療。在攜帶KRAS突變的肺癌臨床研究顯示，KRAS突變與肺癌患者對(duì)吉非替尼和厄洛替尼原發(fā)耐藥相關(guān)，攜帶KRAS突變的患者在厄洛替尼治療中顯示出較差的療效。體細(xì)胞突變目前最常用的方法是ARMS-PCR法，即擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)熒光PCR法，該方法主要用來檢測(cè)點(diǎn)突變，尤其是檢測(cè)突變含量很低的體細(xì)胞突變。熒光PCR的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)靈敏、特異性高：具有模板序列特異的Taqman探針在引物特異的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高了PCR的專一性；每擴(kuò)增一個(gè)特異產(chǎn)物只釋放一個(gè)分子的熒光染料，儀器檢測(cè)的是特異擴(kuò)增的結(jié)果，非特異產(chǎn)物對(duì)檢測(cè)信號(hào)沒有影響，有效提高檢測(cè)的專一性。有多種不同波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)對(duì)可供選擇，使得Taqman探針法可以實(shí)現(xiàn)在同一管內(nèi)檢測(cè)多重PCR，降低成本也提高效率和準(zhǔn)確性避免了熒光染料對(duì)PCR反應(yīng)的影響。RNaseH2是一種廣泛存在于真核生物和原核生物中核糖核酸酶，可以通過斷裂磷酸二酯鍵，有效地移除RNA/DNA雜交鏈中的RNA鏈，在DNA復(fù)制起始、轉(zhuǎn)錄過程中R-loop的移除、DNA的錯(cuò)配修復(fù)、岡崎片段中RNA引物的降解等過程發(fā)揮重要的作用。RNaseH2可以水解各種類型的RNA/DNA雜交鏈，甚至包括僅含單個(gè)核糖核甘酸的雜交鏈。RNaseH2是一種專一識(shí)別RNA-DNA雜合體的酶，并能特異識(shí)別單個(gè)RNA堿基與DNA模板互補(bǔ)的位點(diǎn)。本專利利用RNaseH2和PCR技術(shù)相結(jié)合開發(fā)一種新型的針對(duì)KRAS基因突變的檢測(cè)，目前還沒有查到將該方法運(yùn)用到KRAS基因突變檢測(cè)中的相關(guān)技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
有鑒于此，本專利技術(shù)運(yùn)用了雙相酶系統(tǒng)RNaseH2和DNA聚合酶技術(shù)，自主設(shè)計(jì)相關(guān)基因檢測(cè)的引物和探針序列，進(jìn)一步提供了一種針對(duì)KRAS基因突變進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒，可以更靈敏方便地對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。本專利技術(shù)的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：本專利技術(shù)第一方面提供了一組針對(duì)KRAS基因突變檢測(cè)的引物組合，所述引物組合包括引物序列SEQIDNO.1～SEQIDNO.8。其中，小寫字母a、c、t代表核糖核酸堿基，大寫字母A、T、G、C代表脫氧核糖核酸堿基，所述引物序列SEQIDNO.1～SEQIDNO.7的3'端連接有間隔臂x，這樣使引物能夠特異地與模板序列結(jié)合，并在RNaseH2剪切后能特異擴(kuò)增。本專利技術(shù)第二方面提供了一種針對(duì)KRAS基因突變檢測(cè)的探針，該探針分別位于相應(yīng)靶核酸序列區(qū)域中的一段寡核苷酸單鏈序列，能特異地和靶核酸序列堿基配對(duì)，所述探針包括針對(duì)KRAS基因突變對(duì)應(yīng)的探針序列SEQIDNO.9，序列SEQIDNO.9的5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)。在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選的，所述SEQIDNO.9探針5’端標(biāo)記有FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)BHQ1。本專利技術(shù)第三方面提供了一種針對(duì)KRAS基因突變檢測(cè)的酶混合液，包括RNaseH2和TaqDNA聚合酶，所述RNaseH2酶與TaqDNA聚合酶酶活性濃度比為1:50～1:400，優(yōu)選酶活性濃度比為1:300。本專利技術(shù)第四方面提供了一種針對(duì)KRAS基因突變檢測(cè)的試劑盒，包括上述引物序列SEQIDNO.1～SEQIDNO.8，上述探針序列SEQIDNO.9，上述酶混合液，PCR緩沖液和4種dNTPs。在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選的，所述針對(duì)KRAS基因突變檢測(cè)的試劑盒由以下試劑組成：(1)PCR反應(yīng)預(yù)混液：成分包括PCR緩沖液、4種dNTPs、探針SEQIDNO.9和通用人源性內(nèi)標(biāo)探針、引物由SEQIDNO.1～SEQIDNO.8及通用內(nèi)標(biāo)引物混合而成；(2)酶混合液：成分包括RNaseH2和TaqDNA聚合酶，所述RNaseH2與TaqDNA聚合酶酶活性濃度比為1:50～1:400；(3)陰性質(zhì)控品：構(gòu)建的KRAS基因突變?yōu)殛幮缘馁|(zhì)粒模板；(4)陽(yáng)性質(zhì)控品：構(gòu)建的KRAS基因突變?yōu)殛?yáng)性的質(zhì)粒模板；更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述酶混合液中，RNaseH2與TaqDNA聚合酶酶活性濃度比為1:300。本專利技術(shù)第五方面提供了一種針對(duì)KRAS基因突變檢測(cè)的方法，包括以下步驟：(1)設(shè)計(jì)相關(guān)基因分型的引物和探針序列，所述如引物SEQIDNO.1～SEQIDNO.8所示，所述探針如SEQIDNO.9所示；(2)用DNA提取液提取組織DNA模板；(3)PCR擴(kuò)增檢測(cè)：以步驟(2)提取的組織DNA為模板，利用本專利技術(shù)提供的試劑盒進(jìn)行相應(yīng)的擴(kuò)增檢測(cè)，將PCR反應(yīng)預(yù)混液和酶混合液按照36：0.5的體積比配成混合液后，加入到相應(yīng)的反應(yīng)孔中，然后加入提取的組織DNA模板4μl，同時(shí)做一個(gè)陰性對(duì)照孔和一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔，PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5分鐘，然后95℃變性10秒，58℃退火延伸45秒，共40次循環(huán)，在退火延伸階段收集熒光；(4)結(jié)果判定：根據(jù)各熒光通道的信號(hào)值來判斷是否有擴(kuò)增，有擴(kuò)增就代表該熒光通道對(duì)應(yīng)的檢測(cè)位本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種針對(duì)KRAS基因突變檢測(cè)的引物組合，其特征在于：所述引物組合包括：引物序列SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.8。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種針對(duì)KRAS基因突變檢測(cè)的引物組合，其特征在于：所述引物組合包括：引物序列SEQIDNO.1～SEQIDNO.8。2.一種針對(duì)KRAS基因突變檢測(cè)的探針，其特征在于：所述探針包括針對(duì)KRAS基因突變對(duì)應(yīng)的探針序列SEQIDNO.9，序列SEQIDNO.9的5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)。3.如權(quán)利要求2所述的一種針對(duì)KRAS基因突變檢測(cè)的探針，其特征在于：所述SEQIDNO.9探針5’端標(biāo)記有FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)BHQ1。4.一種針對(duì)KRAS基因突變檢測(cè)的酶混合液，其特征在于：包括RNaseH2和TaqDNA聚合酶，所述RNaseH2和TaqDNA聚合酶酶活性濃度比為1:50～1:400。5.如權(quán)利要求4所述的一種針對(duì)KRAS基因突變檢測(cè)的酶混合液，其特征在于：所述酶混合液中，RNaseH2與TaqDNA聚合酶酶活性濃度比為1:300。6.一種針對(duì)KRAS基因突變檢測(cè)的試劑盒，其特征在于：包括權(quán)利要求1所述的引物序列SEQIDNO.1～SEQIDNO.8、權(quán)利要求2所述探針序列SEQIDNO.9、權(quán)利要求4所述酶混合液、PCR緩沖液和4種dNTPs。7.如權(quán)利要求6所述的一種針對(duì)KRAS基因突變檢測(cè)的試劑盒，其特征在于：包括如下試劑：(1)PCR反應(yīng)預(yù)混液：成分包括PCR緩沖液、4種dNTPs、探針SEQIDNO.9和通用人源性內(nèi)標(biāo)探針、引物由SEQIDNO.1～SEQI...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：徐志勇，秦偉，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：武漢千麥醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：湖北,42