轉基因玉米L239及其子代純合體和雜合體的KASP檢測引物制造技術

本發明專利技術提供用于檢測轉基因玉米L239及其子代和衍生品系純合體和雜合體的KASP引物，引物序列如SEQ?ID?NO:1?3所示。利用本發明專利技術提供的KASP引物，僅通過單個反應就能夠鑒定出轉基因玉米L239及其子代和衍生品系是轉基因純合體、雜合體或野生型。本方法檢測通量遠高于熒光定量PCR和普通PCR，具有準確率高、成本低、自動化程度高以及易于操作等優點。

KASP Primers for Detection of Homozygotes and Heterozygotes in Transgenic Maize L239 and Its Progenies

The present invention provides KASP primers for detecting homozygotes and heterozygotes of genetically modified maize L239 and its offspring and derivatives, with primer sequences as shown in SEQ ID NO:1 3. By using the KASP primers provided by the invention, the transgenic maize L239 and its offspring and derivatives can be identified as homozygotes, heterozygotes or wild types by a single reaction. The detection flux of this method is much higher than that of fluorescent quantitative PCR and ordinary PCR. It has the advantages of high accuracy, low cost, high automation and easy operation.

【技術實現步驟摘要】
轉基因玉米L239及其子代純合體和雜合體的KASP檢測引物
本專利技術屬于分子生物學及植物分子育種領域，具體地說，涉及轉基因玉米L239及其子代和衍生品系純合體和雜合體的KASP檢測引物及應用。
技術介紹
相對于傳統育種技術而言，轉基因育種技術具有精準和高效的優勢。通過遺傳轉化直接獲得的轉基因品系，往往由于綜合農藝性狀表現不佳，不能夠直接應用于生產，需要通過回交的手段，將外源基因導入一個具有優良農藝性狀背景的材料中，然后才能獲得可用于生產的轉基因品系。在回交育種中，需要對轉基因植株中外源片段的純合和雜合情況進行判定。目前主要方法有實時定量PCR、普通PCR以及Southern雜交。上述檢測方法中，普通PCR需要電泳以及紫外觀察的過程，操作繁瑣，耗時長。Southern雜交的過程更加復雜，而且需要用到放射性元素。熒光定量PCR相對前兩者流程簡化了很多，但是如果染色體上有多個外源片段插入時，利用熒光定量PCR的方法進行檢測，結果的準確度會受到影響。三種方法的自動化程度均不高，單位時間內能檢測的樣本數量有限，而且手動操作容易導致實驗誤差和實驗污染。依靠上述常規的方法，很難實現對轉基因作物進行高通量且低成本的純合體和雜合體的有效區分。轉基因玉米L239是袁隆平農業高科技股份有限公司與北京大北農科技基團股份有限公司合作開發的一個對鱗翅目昆蟲具有較好的抗性并對草甘膦除草劑具有較好的耐受性的轉基因玉米自交系，而且農藝性狀表現優良，產量與非轉基因玉米自交系L239相當。因此，亟需開發一種高效且費用低廉的區分轉基因玉米L239及其衍生品系純合體和雜合體的方法。競爭性等位基因PCR(kompetitiveallelespecificPCR，KASP)是一種基于熒光檢測的基因分型技術。該技術現階段主要被應用于SNP或InDel基因分型研究中，正逐漸成為分子輔助育種、性狀基因的精細定位，以及種子資源鑒定的主要技術手段。目前尚未見到利用KASP技術區分轉基因玉米L239及其衍生品系純合體和雜合體的引物及檢測方法。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供轉基因玉米L239及其子代和衍生品系純合體和雜合體的KASP檢測引物及應用。為了實現本專利技術目的，第一方面，本專利技術提供轉基因玉米L239及其子代和衍生品系純合體和雜合體的KASP檢測引物，所述引物包括(SEQIDNO:1-3)：引物F:5’-TAGTACGAAAGCGACCCCACC-3’引物H:5’-CCAACACCGTGAGGCTAGTG-3’引物C:5’-GCAAATAGGAAACAGGAAAGGAGAC-3’第二方面，本專利技術提供含有所述引物F、H和C的檢測試劑或試劑盒。第三方面，本專利技術提供所述引物F、H和C，或含有所述引物的檢測試劑或試劑盒在鑒定或篩選對鱗翅目昆蟲具有較好抗性且對草甘膦除草劑具有較好耐受性的轉基因玉米L239及其子代和衍生品系純合體和雜合體中的應用。進一步地，本專利技術提供一種用于鑒定對鱗翅目昆蟲具有較好抗性且對草甘膦除草劑具有較好耐受性的轉基因玉米L239及其子代和衍生品系純合體和雜合體的方法，包括以下步驟：1)提取待測玉米基因組DNA；2)向步驟1)提取的DNA模板中加入特異的KASPPrimermix和通用的KASPMastermix，進行PCR擴增；3)采用熒光檢測儀分析PCR擴增產物。其中，所述KASPPrimermix中含有三種特異性引物：引物F、H和C，它們的濃度分別為12uM、12uM和30uM。進一步地，所述引物F的5’端添加FAM熒光標簽序列5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，所述引物H的5’端添加HEX熒光標簽序列5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。所述KASPMastermix包含如下各組分：通用的FRETcassette熒光引物，ROX內參染料，KlearTaqDNA聚合酶，dNTP和MgCl2。步驟(2)中采用的PCR反應體系如下：組分384孔板100μMKASPPrimermix0.02-0.022μl2×KASPMastermix0.6-0.9μlDNA模板0.6-0.9μl總體積1.22-1.822μl反應體系優選為：組分384孔板100μMKASPPrimermix0.022μl2×KASPMastermix0.8μlDNA模板0.8μl總體積1.622μl步驟(2)中采用的PCR反應條件如下：90-95℃預變性10-20分鐘；第一步擴增反應，90-95℃變性10-30秒，退火并延伸30-90秒，5-20個TouchDown循環(每個循環退火及延伸的溫度降低0.1-3.0℃)；第二步擴增反應，90-95℃變性10-30秒，57-60℃退火并延伸30-90秒，20-30個循環。優選地，第一步擴增反應，退火起始的溫度為60-65℃，退火結束的溫度57-60℃，退火并延伸30-90秒，經歷5-20個TouchDown循環(每個循環退火及延伸的溫度降低0.15-2.6℃)。PCR反應條件優選為：94℃預變性15分鐘；第一步擴增反應，94℃變性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10個TouchDown循環(每個循環退火及延伸的溫度降低0.8℃)；第二步擴增反應，94℃變性20秒，57℃退火并延伸60秒，35個循環。反應結束后對產物進行熒光掃描。步驟(3)具體為：若擴增產物中檢測到與引物F對應的熒光，則判定待測玉米為野生型，若擴增產物中檢測到與引物H對應的熒光，則判定待測玉米為轉基因純合體，若擴增產物中檢測到兩種不同熒光，則判定待測玉米為轉基因雜合體。在本專利技術的一個具體實施方式中，由于引物F具有FAM標簽序列，引物H具有HEX標簽序列。不同基因型植物樣品的反應產物將具有不同的熒光：(1)野生型植物DNA：利用引物F和引物C能擴增出目的片段，但利用引物H和引物C不能擴增出目的片段；(2)轉基因雜合體植物DNA：利用引物F和引物C、引物H和引物C都能擴增出相應的目的片段；(3)轉基因純合體植物DNA：利用引物H和引物C能擴增出目的片段，但利用引物F和引物C不能擴增出目的片段。因此，利用上述引物進行KASP反應，得到反應產物將釋放出不同的熒光信號，最后能根據熒光信號的種類區分植物樣品是轉基因純合體、雜合體還是野生型。根據上述原理，如果從某樣品的產物中檢測出顯著的FAM熒光和HEX熒光，則表明該樣品是轉基因雜合體；如果僅檢測到顯著的FAM熒光但沒有檢測到HEX熒光，則表明該樣品是不含轉基因片段，可能為野生型；如果檢測到顯著的HEX熒光但沒有檢測到FAM熒光，則表明該樣品是轉基因純合體；如果沒有檢測到顯著的HEX熒光以及FAM熒光，則需要重新檢測(圖2)。因此，本專利技術通過對引物起點位置的設置，可以達到單個反應就能夠確定待測樣品為轉基因純合體、轉基因雜合體或野生型。利用本方法進行檢測時，需向反應體系中加入3條引物，如何保證3條引物之間不互相干擾是本專利技術有效解決的技術問題之一。另外利用本方法對大批量樣品進行高通量檢測時，保證檢測結果的準確性和可靠性是本專利技術成功解決的另一個技術難點。為了測試本專利技術引物的效果以及利用本方法進行高通量檢測的準確性，對已知基因型的轉基因玉米L239樣品進行純合體和雜合體的檢測，然后本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.轉基因玉米L239及其子代和衍生品系純合體和雜合體的KASP檢測引物，其特征在于，所述引物包括：引物F:5’?TAGTACGAAAGCGACCCCACC?3’引物H:5’?CCAACACCGTGAGGCTAGTG?3’引物C:5’?GCAAATAGGAAACAGGAAAGGAGAC?3’。

【技術特征摘要】
1.轉基因玉米L239及其子代和衍生品系純合體和雜合體的KASP檢測引物，其特征在于，所述引物包括：引物F:5’-TAGTACGAAAGCGACCCCACC-3’引物H:5’-CCAACACCGTGAGGCTAGTG-3’引物C:5’-GCAAATAGGAAACAGGAAAGGAGAC-3’。2.含有權利要求1所述引物的檢測試劑或試劑盒。3.權利要求1所述引物或權利要求2所述檢測試劑或試劑盒在鑒定或篩選對鱗翅目昆蟲具有較好抗性且對草甘膦除草劑具有較好耐受性的轉基因玉米L239及其子代和衍生品系純合體和雜合體中的應用。4.用于鑒定對鱗翅目昆蟲具有較好抗性且對草甘膦除草劑具有較好耐受性的轉基因玉米L239及其子代和衍生品系純合體和雜合體的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)提取待測玉米基因組DNA；2)向步驟1)提取的DNA模板中加入特異的KASPPrimermix和通用的KASPMastermix，進行PCR擴增；3)采用熒光檢測儀分析PCR擴增產物；其中，所述KASPPrimermix中含有三種特異性引物：引物F、H和C，它們的定義同權利要求1中所述；所述KASPMastermix包含如下各組分：通用的FRETcassette熒光引物，ROX內參染料，KlearTaqDNA聚合酶，dNTP和MgCl2。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述引...

【專利技術屬性】
技術研發人員：馬麗，應繼鋒，鄒繼軍，鄭秀婷，盧東林，劉歡，賈亞軍，
申請(專利權)人：袁隆平農業高科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：湖南,43