使用等位基因特異的反應性引物的核酸擴增方法技術

本發明專利技術涉及一種使用被設計成解決傳統等位基因特異性PCR的問題的等位基因特異的反應性引物(ASRP)來擴增核酸的方法，更具體地，本發明專利技術涉及靶核酸的檢測方法，包括具有校對活性的DNA聚合酶和與靶核酸互補的堿基序列，其中在ASRP存在下擴增靶核酸，所述ASRP被修飾為使得位于來自與引物5’方向上不互補的核苷酸緊鄰的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的區域中的一個或多個修飾核苷酸，在3'端存在不互補的核苷酸時，該不互補的核苷酸將被DNA聚合酶的校對活性除去，以使等位基因特異的反應性引物中的核苷酸不能作為聚合酶反應的引物。根據本發明專利技術的使用ASRP的檢測方法由于ASRP和校對DNA聚合酶的特性而成為具有非常高特異性的技術，并且能夠有效地檢測包括單核苷酸多態性(SNP)在內的突變(點突變、插入、缺失)。此外，該方法也可以用于檢測亞硫酸氫鹽處理后的CpG甲基化的存在，或者擴增并檢測DNA文庫中從所需核苷酸序列開始的靶DNA。

【技術實現步驟摘要】
使用等位基因特異的反應性引物的核酸擴增方法本專利技術申請是基于申請日為2013年04月16日，申請號為201380077114.X(國際申請號為PCT/KR2013/003185)，專利技術名稱為“使用等位基因特異的反應性引物的核酸擴增方法”的專利申請的分案申請。
本專利技術涉及一種使用被設計成解決傳統等位基因特異性PCR的問題的等位基因特異的反應性引物(ASRP)來擴增核酸的方法，更具體地，涉及用于檢測靶核酸的方法，該方法包括在具有校對活性的DNA聚合酶和等位基因特異的反應性引物(ASRP)存在下擴增靶核酸，所述ASRP包括：i)與靶核酸互補的核苷酸序列，和ii)一個或多個修飾核苷酸，位于來自與引物5’方向上不互補的核苷酸緊鄰的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的區域中，在3'端存在不互補的核苷酸時，該不互補的核苷酸將被DNA聚合酶的校對活性除去，以使等位基因特異的反應性引物中的核苷酸不能作為聚合酶反應的引物。
技術介紹
單核苷酸多態性(SNP)是當一個單核苷酸被其它三種核苷酸之一替換時發生的DNA序列的遺傳變異。它導致個體間的差異，如致病原因或對治療藥物的反應。單核苷酸多態性的檢測和鑒定不僅與個性化的藥物相關聯，也與新藥開發相關聯，因此已經受到了大量的關注。對于單核苷酸多態性的快速檢測，已使用基于實時PCR技術的各種檢測方法。這些檢測方法的典型實例包括使用DNA嵌入熒光染料的測定法，使用DNA探針的測定法和使用PNA探針的測定法。然而，這些方法的缺點在于使用DNA嵌入熒光染料是受限的并且需要使用用于分析熔解曲線的程序(KirkM.Ririeetal.,AnalyticalBiochemistry245:154,1997；U.Hladniketal.,ClinExpMed,2:105,2002)。具有3'→5'校對活性的DNA聚合酶確保了DNA復制的高保真性(Drake,J.W.et.al.,ColdSpringHarb.Symp.Quant.Biol.,33:339,1968；Drake,J.W.et.al.,Nature,221:1128,1968；Goodman,M.F.et.al..Genetics,148:1475,1998)，并且已經發現了很多具有3'核酸外切酶活性的校對聚合酶。具有校對活性的DNA聚合酶確保了體內DNA復制的高保真性，但是，當將具有校對活性的DNA聚合酶應用到利用常規等位基因特異性的引物所進行的聚合酶鏈式反應時，存在這樣的問題，即，因為在3'端不匹配的堿基被除去，所以無論引物與用作模板的DNA是完全雜交或是不完全雜交，引物的末端都會延伸(Zhang,J.etal.,Mol.Biotechnol.,24:105,2003)。由于這個問題，在研究突變檢測中幾乎不使用具有校對活性的DNA聚合酶。然而近幾年，已經出現了針對于使用修飾引物的3’端的方法來檢測靶核酸中的突變的方法的研究，例如標記引物的3’端或將3'核酸外切酶抗性因子綴合至3'端的方法，或除去核苷酸的3'端的-OH基團或用其他殘基置換該-OH基團的方法(Zhang,J.etal.,CurrentDrugDisc.,9:21,2001；Bi,W.L.andSambrook,P.J.,NucleicAcidsRes.,26:3073,1998)。例如，在引物的3'端被標記的情況下，當引物互補結合到模板DNA時，產生擴增終產物，同時在3'端的標簽被保持，但是當引物不匹配模板DNA時，在3'端的標簽被具有校對活性的DNA聚合酶在校對時去除，因此產生不含標簽的擴增終產物，這表明可以基于標記的存在或不存在來檢測突變。基于這個原理，可以將具有以各種方式進行3'端修飾的等位基因特異性引物，以及具有校對活性的DNA聚合酶，應用于包括實時PCR、多孔板和微陣列技術的各種平臺。因此，本專利技術人進行了廣泛的努力，以使用3'端修飾的引物和具有校對活性的DNA聚合酶來檢測靶核酸，并且結果發現，在具有校對活性的DNA聚合酶存在下，使用其中核苷酸的3'端被修飾的等位基因特異的反應性引物(ASRP)，特異地擴增出靶核酸，從而完成了本專利技術。
技術實現思路
技術問題本專利技術的一個目的是提供一種使用等位基因特異的反應性引物(ASRP)來檢測靶核酸的方法，以及用于從DNA文庫選擇性地擴增靶核酸的方法，所述等位基因特異反應性引物(ASRP)包括與靶核酸互補的核苷酸序列，以及一個或多個修飾核苷酸，位于來自與引物5’方向的不互補的核苷酸緊鄰的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的區域中，在3'端存在不互補的核苷酸時，該不互補的核苷酸將被DNA聚合酶的校對活性除去，以使在等位基因特異的反應性引物中的核苷酸不能充當聚合酶反應的引物。技術方案為了達到上述目的，本專利技術提供了一種用于檢測靶核酸的方法，該方法包括在具有校對活性的DNA聚合酶和等位基因特異的反應性引物(ASRP)存在下，擴增靶核酸，所述等位基因特異反應性引物(ASRP)包括：i)與靶核酸互補的核苷酸序列，和ii)一個或多個修飾核苷酸，位于來自與引物5’方向的不互補的核苷酸緊鄰的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的區域中，在3'端存在不互補的核苷酸時，該不互補的核苷酸將被DNA聚合酶的校對活性除去，以使在等位基因特異的反應性引物中的核苷酸不能充當聚合酶反應的引物。本專利技術還提供從DNA文庫擴增以特定核苷酸序列開始的靶核酸的方法，該方法包括在具有校對活性的DNA聚合酶和等位基因特異的反應性引物(ASRP)存在下，從DNA文庫中擴增靶核酸，所述靶核酸包括在其5'端與DNA文庫的接頭序列互補的核苷酸序列，和在3'端與靶核酸互補的核苷酸序列和修飾核苷酸，以便在等位基因特異的反應性引物中的核苷酸不能作為聚合酶反應的引物。本專利技術還提供了一種用于檢測靶核酸的方法，該方法包括在下述物質存在下擴增靶核酸：(i)等位基因特異的反應性引物(ASRP)，所述ASRP包括在其5'端包含與靶核酸不互補的核苷酸序列的標簽序列，修飾單核苷酸和與靶核酸互補的核苷酸序列，所述等位基因特異的反應性引物(ASRP)在其3’端具有一個或多個使得在等位基因特異的反應性引物中的核苷酸不能作為聚合酶反應引物的修飾核苷酸；(ii)標簽序列和報告子模板，所述報告子模板含有與靶核酸互補的核苷酸序列的一部分；和(iii)具有3'→5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶。附圖說明圖1是示出利用等位基因特異的反應性引物(ASRP)的檢測系統的示意圖。圖2示出使用通用引物和ASRP檢測單核苷酸突變來進行PCR擴增實驗的結果。圖3示出使用通用引物和ASRP檢測甲基化來進行PCR擴增實驗的結果。圖4是示出使用等位基因特異的反應性引物(ASRP)從DNA文庫擴增從所需核苷酸序列開始的靶DNA的過程的示意圖。圖5是示出使用等位基因特異的反應性引物(ASRP)和具有3'→5'核酸外切酶活性且沒有校對活性的DNA聚合酶的檢測系統的示意圖，該ASRP包括標簽序列，修飾單核苷酸和與靶核酸互補的靶特異性序列。具體實施方式除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本專利技術所屬領域的技術人員的通常理解相同的含義。通常，本文中使用的命名法是眾所周知且在本領域中常用的。在一個方面，本專利技術涉及一種檢測靶核酸的方法，該方法本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種從DNA文庫中擴增從特定核苷酸序列開始的靶核酸的方法，該方法包括在具有校對活性的DNA聚合酶和等位基因特異的反應性引物(ASRP)存在下，從DNA文庫中擴增靶核酸，所述等位基因特異的反應性引物包括在其5'端與DNA文庫的接頭序列互補的核苷酸序列，和在3'端，與靶核酸互補的核苷酸序列以及使得在等位基因特異的反應性引物中的核苷酸不能作為聚合酶反應引物的修飾核苷酸。

【技術特征摘要】
2013.04.01 KR 10-2013-00353431.一種從DNA文庫中擴增從特定核苷酸序列開始的靶核酸的方法，該方法包括在具有校對活性的DNA聚合酶和等位基因特異的反應性引物(ASRP)存在下，從DNA文庫中擴增靶核酸，所述等位基因特異的反應性引物包括在其5'端與DNA文庫的接頭序列互補的核苷酸序列，和在3'端，與靶核酸互補的核苷酸序列以及使得在等位基因特異的反應性引物中的核苷酸不能作為聚合酶反應引物的修飾核苷酸。2.根據權利要求1的方法，其中所述具有校對活性的DNA聚合酶具有3'→5'核酸外切酶活性。3.根據權利要求1的方法，其中當毗鄰等位基因特異的反應性引物的修飾核苷酸3'側的核苷酸與靶核酸互補時，毗鄰等位基因特異的反應性引物的修飾核苷酸3'側的核苷酸不被DNA聚合酶的校對活性除去，和當毗鄰等位基因特異的反應性引物的修飾核苷酸3'側的核苷酸與靶核酸不互補時，毗鄰等位基因特異的反應性引物的修飾核苷酸3'側的核苷酸被除去，因此修飾核苷酸保持在3'端。4.根據權利要求1的方法，其中所述修飾核苷酸為具有選自脫氧核苷酸反轉(逆轉)的脫氧核苷酸中至少一種的置換的核苷酸。5.根據權利要求1的方法，包括步驟：(a)隨機消化基因組DNA，并將測序接頭序列連接到經消化的DNA片段的5'和3’兩末端，以制備DNA文庫；(b)將DNA文庫與等位基因特異的反應性引物(ASRP)混合并雜交，其中所述等位基因特異的反應性引物(ASRP)包括與DNA文庫的接頭序列互補的核苷酸序列和一個或多個修飾核苷酸，所述修飾核苷酸位于來自與引物5’方向的不互補的核苷酸緊鄰的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的區域中，在3'端存在不互補的核苷酸時，所述不互補的核苷酸被DNA聚合酶的校對活性除去，以便在等位基因特異的反應性引物中的核苷酸不能作為聚合酶反應的引物；和(c)在具有校對活性的DNA聚合酶存在下，進行在(b)的雜交產物中從特定核苷酸序列開始的擴增。6.根據權利要求5的方法，其中等位基因特異的反應性引物的濃度為0.1-20M。7.根據權利要求5的方法，其中在步驟(c)中的擴增是通過PCR來進行。8.根據權利要求5的方法，其中來自DNA文庫的從特定核苷酸序列開始的靶核酸互補地結合等位基因特異的反應性引物，產生擴增產物，并且當等位基因特異的反應性引物與靶核酸不互補時，不匹配的核苷酸被DNA聚合酶的校對活性除去，并且由于殘留在引物3'端的修飾核苷酸，不產生靶核酸的擴增產物。9.根據權利要求1的方法，其中只有甲基化的靶核酸被擴增。10.根據權利要求9的方法，其中所述甲基化的靶核酸的擴增方法包括步驟：(a)化學或酶處理基因組DNA以將未甲基化的胞嘧啶核苷酸轉換為尿嘧啶或其他核苷酸而不轉換甲基化的胞嘧啶核苷酸；(b)隨機消化基因組DNA，并將測序接頭連接到經消化的DNA片段的5'和3'兩端，以構建DNA文庫；(c)將DNA文庫與等位基因特異的反應性引物(ASR...

【專利技術屬性】
技術研發人員：安城皖，吳泰禎，
申請(專利權)人：基因特力株式會社，
類型：發明
國別省市：韓國,KR