變體腺伴隨病毒及使用方法技術

本公開提供了表現出對神經元中的逆行運動的偏愛的AAV變體和使用此類變體的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】變體腺伴隨病毒及使用方法聯邦資助的研究或開發本專利技術是在國立衛生研究院授予的EY022975的政府支持下完成的。政府擁有本專利技術的某些權利。對相關申請的交叉引用本申請要求2016年6月15日提交的美國申請No.62/350,361和2016年10月5日提交的美國申請No.62/404,585的35U.S.C.§119(e)下的優先權權益。專利
本公開一般涉及變體腺伴隨病毒及其制備和使用方法。專利技術背景腦功能諸如感知、認知和運動控制依賴于大規模神經網絡的協調作用，所述大規模神經網絡由進行特定計算并通過分配這些計算的結果的長距離連接而連接在一起的局部回路模塊組成。此類長距離連接由專用的投射神經元形成，所述投射神經元通常包括幾個混合類別，每個類別投射到網絡內的不同下游靶標。也已經在幾種神經變性疾病從空間定位的發作部位的擴散中牽涉投射神經元。因此，選擇性靶向投射神經元的特定類別以用于轉基因遞送(例如用于活性監測/操作或基因組編輯以用于靶向基因敲除或修復病理突變)的能力對于了解大規模網絡如何促成腦功能以及從長遠來看對于神經變性疾病中的治療干預兩者會是重要的。病毒載體構成將轉基因引入特定神經元群體的一類重要工具，并且是迄今為止經由軸突末端處的進入以及將其有效負載(payload)逆行(retrograde)轉運至細胞核的對靶標投射神經元的遺傳接近(geneticaccess)的最佳選擇。許多自然進化的親神經病毒表現出逆行擴散作為其生命周期中的部分，特別包括狂犬病、脊髓灰質炎病毒和單純皰疹病毒(HSV)。在這些中，狂犬病病毒特別是神經侵入性的，并通過跨細胞轉移迅速通過神經系統擴散。然而，盡管在降低其毒性方面正在取得進展，但它在生物調查和基因療法兩者方面的潛力受到過度毒力的阻礙。在天然親神經毒株外，許多其他病毒在直接施用于神經系統時可感染神經元，其中“假狂犬病(pseudorabies)”(SuHV1，實際上是皰疹病毒)、腺病毒和慢病毒在動物研究中最常用。犬腺病毒-2(CAV-2)在這類病毒中表現出最佳的感染性和逆行轉運，并且越來越成為接近投射神經元的選擇試劑。然而，CAV-2僅介導適度水平的轉基因表達，表現出毒性的潛力，并且目前不易與用于產生臨床級或者甚至大型動物研究的可擴展的穩健(robust)生產相容。因此，仍然迫切需要開發無毒性、易于制造的病毒載體，其提供不同轉基因的靈活包裝，被軸突穩健內化和逆向轉運，并且支持長期高水平的有效負載表達。專利技術概述有效逆行接近投射神經元以遞送傳感器和效應器構成了回路切割(circuitdissection)的重要且成為可能的能力。此類方法也可用于基因療法，包括治療以通過功能連接和高度分布的網絡病理擴散為特征的神經變性病癥。特別地，病毒載體是用于神經系統的強大的基因遞送載體，但是所有可用的工具都遭受低效的逆行轉運或有限的臨床潛力。為了滿足此需求，應用體內定向進化以將有力的逆行功能性工程化改造成腺伴隨病毒(AAV)的殼體(已經在神經科學研究和臨床中顯示前景的載體)中。本文所述的變體(稱為rAAV2-retro)允許以與經典的合成逆行標記試劑相當的效率穩健逆行接近投射神經元，并且實現足以在靶向的神經元群體中進行功能性回路詢問和使用CRISPR/Cas9進行的體內基因組編輯的高表達水平。在一方面，提供了病毒殼體蛋白，其包含選自下組的序列：xxDxTKx(SEQIDNO：1)和xDxTKxx(SEQIDNO：2)。在一個實施方案中，病毒殼體蛋白與SEQIDNO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78具有至少95％的序列同一性。在一個實施方案中，病毒殼體蛋白具有SEQIDNO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、或78中顯示的序列。在一個實施方案中，病毒殼體蛋白由與SEQIDNO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、或77具有至少95％序列同一性的核酸編碼。在一個實施方案中，病毒殼體蛋白由具有SEQIDNO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、和77中顯示的序列的核酸編碼。在另一方面，提供了病毒顆粒，其包含如本文所述的病毒殼體蛋白。在一些實施方案中，病毒顆粒表現出對逆行運動的偏愛。在一些實施方案中，病毒顆粒擁有逆行轉運能力。在一些實施方案中，如本文所述的病毒顆粒還包含編碼有效負載的核酸。在一些實施方案中，編碼有效負載的核酸包括與編碼有效負載的編碼序列可操作連接的啟動子序列。代表性的啟動子序列包括但不限于突觸蛋白-1、CMV、GFAP、CAG、CaMKII、MBP、EFlalpha、TRE和mD1x。在一些實施方案中，編碼有效負載的編碼序列選自下組：蛋白質編碼基因和抑制性RNA核酸。在一些實施方案中，抑制性RNA核酸是反義寡核苷酸、siRNA或RNAi。在一些實施方案中，有效負載是效應蛋白。代表性的效應蛋白包括但不限于重組酶(例如，Cre或Flp)、基因編輯系統(例如，CRISPR/Cas9、TALEN、鋅指核酸酶)、光遺傳學試劑(激活劑(例如，通道視紫紅質(channelrhodopsin)或其變體)或抑制劑(例如，鹽細菌視紫紅質(halorhodopsin)或Arch))、化學遺傳學試劑(chemogeneticreagent)(例如，DREADD或PSAM/PSEM系統的激活劑/抑制劑形式)、細胞系統途徑的激活劑和/或抑制劑和用于控制表觀遺傳學(epigenetics)的酶。在一些實施方案中，有效負載是光學報告物構建體。代表性的光學報告物構建體包括但不限于GCaMP6(s、m或f)、熒光團(例如綠色熒光蛋白(GFP)、增強型GFP(EGFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、黃色熒光蛋白(YFP)，tdTomato)、顏色翻轉構建體(color-flippingconstruct)(例如，在一種細胞群體中表達一種報告物并在另一種群體中表達不同報告物的有效負載)、葡萄糖傳感器、jRCaMP、jRGECO、和CaMPARI、電壓指示器、第二信使、受體信號物(receptorsignaler)、轉錄報告物、表觀遺傳報告物和神經調節劑報告物。在一些實施方案中，有效負載是病毒蛋白。代表性的病毒蛋白是狂犬病病毒G蛋白。在一些實施方案中，病毒蛋白是互補除AAV之外的病毒或與細胞和跨細胞轉運有關的蛋白質的功能的蛋白質。在一些實施方案中，編碼有效負載的編碼序列是治療基因。在一些實施方案中，治療基因本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.病毒殼體蛋白，其包含選自下組的序列：xxDxTKx(SEQ?ID?NO:1)和xDxTKxx(SEQ?ID?NO:2)。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2016.06.15 US 62/350,361;2016.10.05 US 62/404,5851.病毒殼體蛋白，其包含選自下組的序列：xxDxTKx(SEQIDNO:1)和xDxTKxx(SEQIDNO:2)。2.權利要求1的病毒殼體蛋白，其中所述病毒殼體蛋白與選自下組的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性：SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76和78。3.權利要求1的病毒殼體蛋白，其中所述病毒殼體蛋白具有選自下組的氨基酸序列：SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76和78。4.權利要求1的病毒殼體蛋白，其中所述病毒殼體蛋白由與選自下組的核酸序列具有至少95％序列同一性的核酸編碼：SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75和77。5.權利要求1的病毒殼體蛋白，其中所述病毒殼體蛋白由具有選自下組的序列的核酸編碼：SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75和77。6.病毒顆粒，其包含權利要求1-5中任一項的病毒殼體蛋白。7.權利要求6的病毒顆粒，其中所述病毒顆粒表現出對逆行運動的偏愛。8.權利要求6的病毒顆粒，其中所述病毒顆粒擁有逆行轉運能力。9.權利要求6-8中任一項的病毒顆粒，其還包含編碼有效負載(payload)的核酸。10.權利要求9的病毒顆粒，其中所述編碼有效負載的核酸包含與編碼所述有效負載的編碼序列可操作連接的啟動子序列。11.權利要求10的病毒顆粒，其中所述啟動子選自下組：突觸蛋白-1、CMV、GFAP、CAG、CaMKII、MBP、EF1alpha、TRE和mDlx。12.權利要求10或11的病毒顆粒，其中所述編碼有效負載的編碼序列選自下組：蛋白質編碼基因和抑制性RNA核酸。13.權利要求12的病毒顆粒，其中所述抑制性RNA核酸是反義寡核苷酸、siRNA或RNAi。14.權利要求9的病毒顆粒，其中所述有效負載是效應蛋白。15.權利要求14的病毒顆粒，其中所述效應蛋白選自下組：重組酶(例如，Cre或Flp)、基因編輯系統(例如，CRISPR/Cas9、TALEN、鋅指核酸酶)、光遺傳學試劑(激活劑(例如，通道視紫紅質(channelrhodopsin)或其變體)或抑制劑(例如，鹽細菌視紫紅質(halorhodopsin)或Arch))、化學遺傳學試劑(例如，DREADD或PSAM/PSEM系統的激活劑/抑制劑形式)、細胞系統途徑的激活劑和/或抑制劑和用于控制表觀遺傳學(epigenetics)的酶。16.權利要求9的病毒顆粒，其中所述有效負載是光學報告物構建體。17.權利要求16的病毒顆粒，其中所述光學報告物構建體選自下組：GCaMP6(s、m或f)、熒光團(例如綠色熒光蛋白(GFP)、增強型GFP(EGFP)、紅色熒...

【專利技術屬性】
技術研發人員：BY黃，A卡爾波瓦，J杜德曼，A漢特曼，L洛杰，K里托拉，D謝弗，DGR特沃，S維斯瓦納森，
申請(專利權)人：霍華休斯醫學研究院，加利福尼亞大學董事會，
類型：發明
國別省市：美國,US