一種熒光定量PCR檢測鑒定皺紋盤鮑的方法技術

本發明專利技術提供了一種熒光定量PCR檢測鑒定皺紋盤鮑的方法，屬于物種資源鑒定技術領域。本發明專利技術方法包括應用特異性引物及探針對皺紋盤鮑的分子特征進行識別。本發明專利技術方法能夠快速、準確地檢測鑒定皺紋盤鮑，不僅具有特異性強、靈敏度高、耗時短、結果判定準確方便的優點，而且無需PCR后處理，能有效避免假陽性和交叉污染。本發明專利技術為進出境物種資源查驗、漁業生產、消費及貿易中快速精準鑒定皺紋盤鮑提供了新的技術手段。

A Method for Detecting and Identifying Haliotis discus hannai by Fluorescence Quantitative PCR

The invention provides a method for detecting and identifying Haliotis discus hannai by fluorescence quantitative PCR, which belongs to the technical field of species resource identification. The method comprises the application of specific primers and probes to recognize the molecular characteristics of Haliotis discus hannai. The method can detect and identify Haliotis discus hannai quickly and accurately. It not only has the advantages of strong specificity, high sensitivity, short time-consuming, accurate and convenient result determination, but also does not need post-processing of PCR, and can effectively avoid false positive and cross-contamination. The present invention provides a new technical means for rapid and accurate identification of Haliotis discus hannai in inbound and outbound species resources inspection, fishery production, consumption and trade.

【技術實現步驟摘要】
一種熒光定量PCR檢測鑒定皺紋盤鮑的方法
本專利技術涉及一種熒光定量PCR檢測鑒定皺紋盤鮑的方法，屬于物種資源鑒定
，適用于進出境物種資源查驗、漁業生產、消費及貿易中皺紋盤鮑的快速精準鑒定和真偽鑒別。
技術介紹
皺紋盤鮑HaliotisdiscushannaiIno屬于軟體動物門Mollusca，腹足綱Gastropoda，前腮亞綱Prosobranchia，原始腹足目Archaeogastropoda，鮑科Haliotidae，鮑屬Haliotis，是經濟價值很高的水產珍品。鮑魚殼是我國醫藥史上應用很早的中醫藥材，名叫石決明，有明目除熱、平肝、潛陽、通淋之效，主治肝阻上亢、頭目眩暈、青盲內障、吐血、失眠等癥，還能外治潰瘍、金瘡。鮑魚肉性溫、味咸，有滋補肝腎、鎮靜、化痰、調經、潤燥、利腸之功能。皺紋盤鮑為鮑類上品，不僅個大體肥，肉細味鮮，而且營養豐富，被稱為“海味之冠”。除鮮食外，皺紋盤鮑亦可加工成罐頭或鮑魚干，市面上的售價均不菲，廣受人們的追捧。皺紋盤鮑與其近似種日本盤孢、黑唇鮑、綠唇鮑、雜色鮑、石磺（土鮑）等外觀極為相似，單從外部形態學上難以區別。加之同種皺紋盤鮑因地域差異、養殖方式、投喂餌料等不同，鮑魚殼的形態也會有所變化，鑒定則更為困難。皺紋盤鮑及其產品的精準鑒定和真偽鑒別問題亟待解決。隨著分子生物學技術飛速發展，運用熒光定量PCR技術在反應體系中加入熒光染料，通過熒光信號的傳遞來反映DNA擴增量，可以實現快而準的檢測鑒定。迄今為止，尚未見用于皺紋盤鮑檢測鑒定的熒光定量PCR技術。如果能設計出特異性引物及探針用熒光定量PCR擴增方法為皺紋盤鮑的快速準確鑒定提供新的技術手段，這個難題就迎刃而解。本專利技術建立了一種熒光定量PCR方法檢測鑒定皺紋盤鮑的技術。
技術實現思路
本專利技術針對傳統形態學和普通PCR鑒定技術所存在的不足開展研究，旨在提供一種準確性好、靈敏度高、特異性強的檢測方法，應用于皺紋盤鮑的快速檢測鑒定。本專利技術提供了一種熒光定量PCR檢測鑒定皺紋盤鮑的方法，所述方法是應用特異性引物及熒光探針對皺紋盤鮑的分子特征進行識別，所述引物及熒光探針為：上游引物為HDF：5’-ACGTGTGAAAGCACAACCTC-3’，下游引物為HDR：5’-GGCCGGGTCAAAGAATGATG-3’，熒光探針為HDP：5’-FAM-TCACTGCCTGTTCTAGCAGGTGCT–BHQ1-3’，5’端標記的熒光報告基團是FAM，3’端標記的熒光淬滅基團是BHQ1，以上引物及探針濃度均為10μmol/L。所述熒光定量PCR反應體系總體積為25μL，其中2×PremixExTaqTMPCR（ProbeqPCR）12.5μL，上、下游引物及探針各1μL，100ng/μLDNA模板2μL，ROXII0.5μL，余下用滅菌ddH2O補足。所述熒光定量PCR反應的程序為：95℃預變性5min；95℃10s，60℃34s，40個循環；結束反應。所述熒光定量PCR反應結束后根據擴增曲線判定結果，判定方法如下：在空白對照及陰性對照無Ct值且無擴增曲線條件下，若待測樣品出現典型擴增曲線，且Ct值小于或等于35時，判定為皺紋盤鮑；若Ct值等于40時，判定為非皺紋盤鮑。若Ct值大于35且小于40時，應重新進行測試：Ct值等于40時，判定為非皺紋盤鮑；Ct值小于40時，則判定為皺紋盤鮑。本專利技術的顯著優點：本專利技術方法能夠快速、準確地檢測鑒定皺紋盤鮑。本專利技術為口岸物種資源查驗以及漁業生產消費和貿易中快速精準鑒定皺紋盤鮑提供了新的技術手段。本專利技術所提供的一種熒光定量PCR檢測鑒定皺紋盤鮑的方法具有以下有益效果：1、特異性強：所采用的熒光引物及探針是針對皺紋盤鮑的COI基因序列設計出的特異性引物及探針，一對特異性引物和一條特異性探針可以對靶目標進行雙重控制，特異性強。2、靈敏度高：對皺紋盤鮑的檢測靈敏度在DNA水平上可達到10pg/μL。3、結果判定準確方便：本專利技術所設計出的一種檢測鑒定皺紋盤鮑的特異性引物及探針，僅對皺紋盤鮑進行檢測，已經對近緣種日本盤鮑、黑唇鮑、綠唇鮑、雜色鮑、紅鮑、大鮑、石磺（土鮑）共計7種代表性鮑魚進行了測試驗證，且PCR擴增結果可以在電腦上直接顯示，無需其他額外步驟，因此結果判定準確方便。4、實用性好：當傳統分類學方法難以鑒定皺紋盤鮑時，本專利技術方法用分子生物學技術進行彌補，從而得到快速、準確、靈敏度高的檢測皺紋盤鮑的熒光定量PCR方法。因此本方法的實用性好，可滿足對皺紋盤鮑進行快速可靠的檢測和鑒定的需要。附圖說明圖1為皺紋盤鮑熒光定量PCR引物特異性試驗結果。其中：曲線1為皺紋盤鮑HaliotisdiscushannaiIno；曲線2為日本盤鮑HaliotisdiscusdiscusReeve；曲線3為黑唇鮑Haliotisrubra；曲線4為綠唇鮑Haliotislaevigata；曲線5為雜色鮑Haliotisdiversicolor；曲線6為紅鮑HaliotisrufescensSwainson；曲線7為大鮑HaliotisgiganteanGmelin；曲線8為石磺（土鮑）OnchidiumverruculatumCuvier；曲線9為空白對照。圖2為皺紋盤鮑熒光定量PCR檢測靈敏度試驗結果。其中曲線1為100ng/μL；曲線2為10ng/μL；曲線3為1ng/μL；曲線4為100pg/μL；曲線5為10pg/μL；曲線6為1pg/μL；曲線7為100fg/μL；曲線8為10fg/μL；曲線9為1fg/μL；曲線10為空白對照。圖3為鮑魚及其制品熒光定量PCR真偽鑒別試驗結果。其中曲線1為鮮鮑；曲線2為鮑魚干；曲線3為清蒸鮑魚；曲線4為鮑魚罐頭；曲線5為黑唇鮑（清蒸）；曲線6為空白對照。具體實施方式實施例1:皺紋盤鮑熒光定量PCR引物特異性試驗1、材料的準備供試鮑魚如下：皺紋盤鮑、日本盤鮑；黑唇鮑；綠唇鮑；雜色鮑；紅鮑；大鮑；石磺（土鮑）。以上供試鮑魚系通過國內調查采集獲得，經原質檢總局國家軟體動物檢疫鑒定重點實驗室確認后，置于-20℃保存備用。2、熒光定量PCR方法的建立2.1、引物的設計合成：基于皺紋盤鮑COI基因序列，用引物設計軟PrimerExpress3輔助設計和分析引物，經NCBIBlast檢驗其特異性后，交由上海生工生物技術服務有限公司合成。經反復比對測試最終確定的最優引物如下：上游引物為HDF：5’-ACGTGTGAAAGCACAACCTC-3’，下游引物為HDR：5’-GGCCGGGTCAAAGAATGATG-3’，熒光探針為HDP：5’-FAM-TCACTGCCTGTTCTAGCAGGTGCT–BHQ1-3’，5’端標記的熒光報告基團是FAM，3’端標記的熒光淬滅基團是BHQ1。2.2、DNA提取：TIANGEN組織基因組DNA提取試劑盒提取，按使用說明書操作提取DNA。用核酸蛋白分析儀測定DNA的濃度，最后用TE溶液將DNA稀釋至100ng/μL，置于-20℃保存備用。2.3、熒光定量PCR擴增反應體系：總體積為25μL，其中2×PremixExTaqTMPCR（ProbeqPCR）12.5μL，上、下游引物及探針各1μL，100ng/μLDNA模板2μL，ROXII0.5本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種熒光定量PCR檢測鑒定皺紋盤鮑的方法，其特征在于：所述方法是應用特異性引物及熒光探針對皺紋盤鮑的分子特征進行識別，所述引物及熒光探針為：上游引物為HDF：5’??ACGTGTGAAAGCACAACCTC??3’，下游引物為HDR：5’??GGCCGGGTCAAAGAATGATG??3’，熒光探針為HDP：5’?FAM??TCACTGCCTGTTCTAGCAGGTGCT?–BHQ1?3’，5’端標記的熒光報告基團是FAM，3’端標記的熒光淬滅基團是BHQ1，以上引物及探針濃度均為10μmol/L。

【技術特征摘要】
1.一種熒光定量PCR檢測鑒定皺紋盤鮑的方法，其特征在于：所述方法是應用特異性引物及熒光探針對皺紋盤鮑的分子特征進行識別，所述引物及熒光探針為：上游引物為HDF：5’-ACGTGTGAAAGCACAACCTC-3’，下游引物為HDR：5’-GGCCGGGTCAAAGAATGATG-3’，熒光探針為HDP：5’-FAM-TCACTGCCTGTTCTAGCAGGTGCT–BHQ1-3’，5’端標記的熒光報告基團是FAM，3’端標記的熒光淬滅基團是BHQ1，以上引物及探針濃度均為10μmol/L。2.根據權利要求1所述的一種熒光定量PCR檢測鑒定皺紋盤鮑的方法，其特征在于：所述熒光定量PCR反應體系總體積為25μL，其中2×PremixExTaqTMPCR（P...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王沛，胡美玲，周衛川，
申請(專利權)人：福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，
類型：發明
國別省市：福建,35