DNA甲基化檢測方法及相關(guān)應(yīng)用技術(shù)

本公開提供用于DNA甲基化檢測的方法、試劑、試劑盒及相關(guān)的應(yīng)用，進(jìn)一步提供RNF180基因或Reprimo基因甲基化的檢測方法、核酸、試劑盒和應(yīng)用，所述方法、核酸、試劑盒等可用于癌癥診斷和/或預(yù)后。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
DNA甲基化檢測方法及相關(guān)應(yīng)用
本公開屬于生物
，涉及體外診斷技術(shù)。具體地講，本公開涉及用于DNA甲基化檢測的方法、試劑、試劑盒及相關(guān)的應(yīng)用，涉及用于癌癥診斷和/或預(yù)后的方法、產(chǎn)品(包括試劑、試劑盒)。
技術(shù)介紹
惡性腫瘤是威脅人類生命健康的一類重大疾病。雖然腫瘤的治療有了長足的進(jìn)步，但高死亡率仍未得到有效控制。根據(jù)國家癌癥中心最新一期的全國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(來源于2017年全國腫瘤登記中心收集匯總的全國31省市自治區(qū)腫瘤登記處2014年的惡性腫瘤登記資料)顯示，全國惡性腫瘤新發(fā)病例數(shù)380.4萬例，標(biāo)化發(fā)病率174.0/10萬，略低于世界平均水平182.3/10萬。但中國癌癥發(fā)病約占全球的22％，發(fā)病人數(shù)全球第一。中國癌癥死亡病例超200萬，約占全球的27％，標(biāo)化死亡率122.2/10萬，高于世界平均水平102.4/10萬。由于缺乏癌癥早篩以及就診時(shí)間偏晚等原因，中國癌癥的5年生存率僅為30.9％，而發(fā)達(dá)國家普遍在70％以上。以胃癌為例，我國每年新增胃癌病例約68萬，死亡人數(shù)約49.8萬；發(fā)病人數(shù)約占世界年新發(fā)病例數(shù)的50％。胃癌患者5年生存率與介入時(shí)期密切相關(guān)，中晚期胃癌5年生存率低于15％，而早期胃癌患者5年生存率超過90％。因此提升胃癌早期診斷和篩查水平，對于控制胃癌人群增長、延長患者生存期和提高生存質(zhì)量均有重要意義。現(xiàn)階段，內(nèi)鏡(胃鏡)為主的影像學(xué)檢查廣泛應(yīng)用于臨床和體檢。結(jié)合切片病理分析，胃鏡檢查可發(fā)現(xiàn)早期胃癌黏膜改變，但仍存在IIb型早期胃癌難發(fā)現(xiàn)，活檢準(zhǔn)確取材成功率不穩(wěn)定導(dǎo)致誤診風(fēng)險(xiǎn)等問題。且胃鏡依從性較差，70％的受檢人會(huì)因其侵入性產(chǎn)生恐懼、緊張和焦慮情緒，所以多數(shù)患者，尤其老年人，不愿意接受胃鏡檢查。而由于操作人員經(jīng)驗(yàn)不足或設(shè)備清潔不當(dāng)導(dǎo)致的上消化道損傷和交叉感染的情況也時(shí)有報(bào)道。其它如X射線或CT掃描等影像檢查手段多應(yīng)用于術(shù)前評(píng)價(jià)和手術(shù)方案制定，早期診斷意義有限。而蛋白分子標(biāo)志物，如CEA及CA19-9等的檢測，對胃癌特異性較低，通常作為預(yù)后監(jiān)測指標(biāo)。綜上，開發(fā)新型胃癌早期診斷技術(shù)，實(shí)現(xiàn)胃癌早期、靈敏、特異診斷，意義重大。近年來，研究發(fā)現(xiàn)分離自腫瘤患者血漿的DNA中存在基因甲基化水平異常；基因甲基化可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要分子特征。環(huán)指蛋白180(ringfingerprotein180，RNF180)具有抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，參與胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移。近年研究發(fā)現(xiàn)RNF180基因的啟動(dòng)子序列內(nèi)的CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)與胃癌發(fā)生、病程發(fā)展和患者預(yù)后之間關(guān)系緊密。一些研究提示，RNF180基因甲基化檢測可能具有胃癌體外分子診斷的應(yīng)用價(jià)值。Reprimo是一種糖基化胞漿蛋白，作為p53的下游效應(yīng)器，引起細(xì)胞周期的G2/M期阻滯，具有抑制細(xì)胞增殖的作用。據(jù)報(bào)道，在胃癌中，Reprimo作為抑癌基因，由于啟動(dòng)子區(qū)域的異常甲基化狀態(tài)，其表達(dá)在部分樣本中缺失。研究提示，Reprimo或其甲基化在胃癌診斷方面可能具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。傳統(tǒng)的甲基化檢測包括甲基化特異性PCR(MSP)、甲基化特異性熒光PCR法(methylight)及亞硫酸氫鹽測序法。甲基化特異性PCR(MSP)及甲基化特異性熒光PCR法(methylight)均是通過對樣本DNA進(jìn)行亞硫酸鹽處理，在保留甲基化胞嘧啶的同時(shí)將非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶；再分別通過甲基化/非甲基化特異性的引物來進(jìn)行PCR配合瓊脂膠電泳后顯影或使用熒光PCR發(fā)光法來檢測樣本DNA中的甲基化程度。亞硫酸鹽測序同樣先對樣本DNA進(jìn)行亞硫酸鹽處理并用通用引物(不含有CpG島，因此可用同時(shí)擴(kuò)增甲基化模板及非甲基化模板)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；再將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，根據(jù)甲基化序列與非甲基化序列的差異來識(shí)別樣本DNA中的甲基化位點(diǎn)及程度。但亞硫酸氫鹽測序法成本高、通量低、操作繁瑣，不利于廣泛應(yīng)用于早期診斷及篩查。而甲基化特異性PCR(MSP)及甲基化特異性熒光PCR法(methylight)在引物特異性上始終存在缺陷，甲基化引物也有一定概率可以通過錯(cuò)配而擴(kuò)增非甲基化模板：理論上，單個(gè)引物含有的CpG序列不會(huì)超過3個(gè)，因此非甲基化模板的一對引物至多只有6個(gè)堿基位點(diǎn)與甲基化引物不匹配。而甲基化檢測的樣本是甲基化模板與非甲基化模板的混合物，且非甲基化模板通常占到總模板量的90％以上，故MSP及methylight存在假陽性的缺陷。因此，特異性地排除掉甲基化引物錯(cuò)配到非甲基化模板在實(shí)際測量中顯得尤為重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
：為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本專利技術(shù)人進(jìn)行了大量的研究，提供以下技術(shù)方案。1.一種DNA甲基化檢測方法，該方法包括：(1)用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶處理一部分DNA樣本，和(2)對于經(jīng)過所述酶處理過的DNA樣本和未經(jīng)所述酶處理的DNA樣本，對待測DNA中含有至少一段所述酶所識(shí)別序列的序列進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)經(jīng)過所述酶處理的DNA樣本的擴(kuò)增結(jié)果和未經(jīng)所述酶處理的DNA樣本的擴(kuò)增結(jié)果，確定所述基因的甲基化情況。2.一種DNA甲基化檢測試劑盒，其中所述試劑盒包含：甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶和用于DNA擴(kuò)增的試劑。3.甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶在制備DNA甲基化檢測試劑盒中的用途，其中所述試劑盒包含用于DNA擴(kuò)增的試劑。4.根據(jù)項(xiàng)2或3所述的試劑盒或用途，其中所述試劑包括用于對待測DNA中含有至少一段所述酶所識(shí)別序列的序列進(jìn)行擴(kuò)增和/或檢測的試劑，例如擴(kuò)增引物和/或檢測探針。5.根據(jù)項(xiàng)1-4中任一項(xiàng)所述的方法、試劑盒或用途，其中所述酶特異性地切割未甲基化序列或切割甲基化序列。6.根據(jù)項(xiàng)1-5中任一項(xiàng)所述的方法、試劑盒或用途，其中所述酶特異性地切割未甲基化序列，所述酶優(yōu)選為選自在酶識(shí)別序列中含有CpG的甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶，更優(yōu)選為選自BstUI酶、HpaII酶和HhaI酶的一種或更多種酶。7.根據(jù)項(xiàng)1-5中任一項(xiàng)所述的方法、試劑盒或用途，其中所述酶特異性地切割甲基化序列，所述酶優(yōu)選為選自在酶識(shí)別序列中含有CpG的甲基化特異性限制性內(nèi)切酶，更優(yōu)選為McrBC。8.根據(jù)項(xiàng)4-7中任一項(xiàng)所述的方法、試劑盒或用途，其中所使用的上游和/或下游擴(kuò)增引物和/或檢測探針含有所述酶所識(shí)別的序列。9.根據(jù)項(xiàng)1-8中任一項(xiàng)所述的方法、試劑盒或用途，所述方法或試劑盒用于癌癥的診斷和/或預(yù)后；所述癌癥優(yōu)選為選自胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌和頭頸癌中的一種或更多種癌，更優(yōu)選為胃癌。10.根據(jù)項(xiàng)1-9中任一項(xiàng)所述的方法、試劑盒或用途，其中所述待測DNA為RNF180基因，優(yōu)選擴(kuò)增RNF180基因中包含選自SEQIDNO:1-3的序列、或擴(kuò)增選自SEQIDNO:1-3的序列。11.根據(jù)項(xiàng)10所述的方法、試劑盒或用途，其中所述擴(kuò)增引物和/或探針包含或?yàn)檫x自SEQIDNO:4-6的序列。12.根據(jù)項(xiàng)1-9中任一項(xiàng)所述的方法、試劑盒或用途，其中所述待測DNA為Reprimo基因，優(yōu)選擴(kuò)增Reprimo基因中包含選自SEQIDNO:7-9的序列、或擴(kuò)增選自SEQIDNO:7-9的序列。13.根據(jù)項(xiàng)12所述的方法、試劑盒或用途，其中所述擴(kuò)增引物和/或探針包含或?yàn)檫x自SEQIDNO:10-12的序列。14.一種DNA甲基化檢測方法，所述方法包括：對DNA樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，以轉(zhuǎn)化處理后的本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種DNA甲基化檢測方法，該方法包括：(1)用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶處理一部分DNA樣本，(2)對于經(jīng)過所述酶處理過的DNA樣本和未經(jīng)所述酶處理的DNA樣本，對待測DNA中含有至少一段所述酶所識(shí)別序列的序列進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)經(jīng)過所述酶處理的DNA樣本的擴(kuò)增結(jié)果和未經(jīng)所述酶處理的DNA樣本的擴(kuò)增結(jié)果，確定所述基因的甲基化情況。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種DNA甲基化檢測方法，該方法包括：(1)用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶處理一部分DNA樣本，(2)對于經(jīng)過所述酶處理過的DNA樣本和未經(jīng)所述酶處理的DNA樣本，對待測DNA中含有至少一段所述酶所識(shí)別序列的序列進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)經(jīng)過所述酶處理的DNA樣本的擴(kuò)增結(jié)果和未經(jīng)所述酶處理的DNA樣本的擴(kuò)增結(jié)果，確定所述基因的甲基化情況。2.一種DNA甲基化檢測試劑盒，其中所述試劑盒包含：甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶和用于DNA擴(kuò)增的試劑。3.甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶在制備DNA甲基化檢測試劑盒中的用途，其中所述試劑盒包含用于DNA擴(kuò)增的試劑。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒或用途，其中所述試劑包括用于對待測DNA中含有至少一段所述酶所識(shí)別序列的序列進(jìn)行擴(kuò)增和/或檢測的試劑，例如擴(kuò)增引物和/或檢測探針。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法、試劑盒或用途，其中所述酶特異性地切割未甲基化序列或切割甲基化序列。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法、試劑盒或用途，其中所述...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：于浩洋，梁寧，呂禾，
申請(專利權(quán))人：深圳市晉百慧生物有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東,44