用于多重檢測(cè)甲基化DNA的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種用于多重檢測(cè)靶標(biāo)DNA的甲基化的方法和一種用于檢測(cè)靶標(biāo)DNA的甲基化的組合物，并且更具體地，涉及一種用于通過(guò)如下方式檢測(cè)靶標(biāo)DNA的甲基化的方法：構(gòu)建包含能夠與該靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的靶標(biāo)特異性序列和不能夠與該靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的通用引物的寡核苷酸，用該寡核苷酸充當(dāng)引物對(duì)該靶標(biāo)DNA進(jìn)行線性擴(kuò)增，并通過(guò)能夠與該線性擴(kuò)增的DNA互補(bǔ)結(jié)合的該寡核苷酸、該通用引物和探針對(duì)該線性擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA進(jìn)行擴(kuò)增。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】用于多重檢測(cè)甲基化DNA的方法
本公開(kāi)文本涉及一種用于多重檢測(cè)靶標(biāo)DNA的甲基化的方法和一種用于檢測(cè)靶標(biāo)DNA的甲基化的組合物，并且更具體地，涉及一種用于檢測(cè)靶標(biāo)DNA的甲基化的方法，其包括：構(gòu)建寡核苷酸，其包含能夠與靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的靶標(biāo)特異性序列和與靶標(biāo)DNA不互補(bǔ)的人工引物；通過(guò)使用該寡核苷酸作為初級(jí)引物對(duì)靶標(biāo)DNA進(jìn)行線性擴(kuò)增用于線性靶標(biāo)富集(下文稱為L(zhǎng)TE)；使用來(lái)自用作初級(jí)引物的寡核苷酸(其能夠與該線性擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合)的分離物和與該線性擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA不互補(bǔ)的通用引物對(duì)該線性擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA進(jìn)行擴(kuò)增；并且通過(guò)探針檢測(cè)是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物。
技術(shù)介紹
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組DNA中，除了A、C、G和T外還有第五個(gè)堿基，即5-甲基胞嘧啶，其中一個(gè)甲基基團(tuán)與胞嘧啶環(huán)的第五個(gè)碳附接(5-mC)。5-mC總是僅與CG二核苷酸(5’-mCG-3’)的C附接，該CG二核苷酸通常被標(biāo)記為CpG。CpG的C大多通過(guò)與甲基附接而甲基化。該CpG的甲基化抑制了基因組中的重復(fù)序列(如Alu或轉(zhuǎn)座子)的表達(dá)。此外，該CpG是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最常出現(xiàn)表觀遺傳變化的位點(diǎn)。該CpG的5-mC天然脫氨至T，并且因此，哺乳動(dòng)物基因組中的CpG顯示的頻率僅為1％，遠(yuǎn)低于正常頻率(1/4x1/4＝6.25％)。CpG異常整合的區(qū)域稱為CpG島。術(shù)語(yǔ)“CpG島”是指長(zhǎng)度為0.2-3kb并且C+G含量大于50％并且CpG比例大于3.75％的位點(diǎn)。人類基因組中有約45,000個(gè)CpG島，并且主要在調(diào)節(jié)基因表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)它們。實(shí)際上，CpG島出現(xiàn)在占人類基因約50％的管家基因的啟動(dòng)子中。已知異常DNA甲基化主要發(fā)生在基因的5’調(diào)節(jié)區(qū)，以減少基因的表達(dá)。在本文中，基因的5’調(diào)節(jié)區(qū)包括啟動(dòng)子區(qū)、增強(qiáng)子區(qū)和＝5’非翻譯區(qū)。最近，有人積極地進(jìn)行了檢查血液、痰、唾液、糞便或尿液中腫瘤相關(guān)基因的啟動(dòng)子甲基化并將檢查結(jié)果用于各種癌癥的診斷和治療的嘗試。眾所周知，DNA通過(guò)包括細(xì)胞凋亡和壞死的過(guò)程從癌癥患者的癌組織中的異常細(xì)胞釋放到血液中，并且因此在血液的血清或血漿中以無(wú)細(xì)胞腫瘤DNA的形式存在，并且甲基化的DNA片段也存在于無(wú)細(xì)胞腫瘤DNA中。這種異常DNA甲基化的存在已被用作診斷癌癥的一種標(biāo)志物。同時(shí)，一般來(lái)說(shuō)，用于分析基因甲基化的方法是通過(guò)檢測(cè)不參與甲基化的對(duì)照基因、通過(guò)PCR以證實(shí)PCR的適合性和輸入DNA的存在與否、以及與其平行進(jìn)行PCR以檢測(cè)靶標(biāo)DNA的甲基化。具體而言，作為通過(guò)實(shí)時(shí)PCR來(lái)分析甲基化的方法，可以考慮以下方法：i)使用靶標(biāo)DNA甲基化非依賴性引物作為實(shí)時(shí)PCR的引物并使用能夠與甲基化靶標(biāo)DNA雜交的甲基化特異性檢測(cè)引物以檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法；ii)使用靶標(biāo)DNA甲基化特異性引物作為實(shí)時(shí)PCR引物并使用能夠與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有的甲基化非依賴性序列雜交的檢測(cè)探針的方法；并且iii)使用靶標(biāo)DNA甲基化特異性引物作為實(shí)時(shí)PCR引物并使用能夠與甲基化靶標(biāo)DNA雜交的甲基化特異性檢測(cè)探針以檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。然而，這些方法都直接使用未富集的DNA作為模板，并且必須同時(shí)使用兩種引物(正向和反向)來(lái)擴(kuò)增靶標(biāo)DNA。因此，每當(dāng)待在一個(gè)試管(單個(gè)反應(yīng)器)中擴(kuò)增的靶標(biāo)增加時(shí)，存在進(jìn)一步需要兩種引物的問(wèn)題。用于多重PCR的引物被設(shè)計(jì)為使得單個(gè)試管中的不同引物可具有相似的雜交特性。在一定程度上退火溫度和引物濃度可以通過(guò)計(jì)算得出，或者也可以憑經(jīng)驗(yàn)使用。由于每次添加引物對(duì)時(shí)非特異性雜交會(huì)增加，每添加一個(gè)引物對(duì)時(shí)應(yīng)修改反應(yīng)條件。此外，歸因于引物對(duì)的耗盡等可能發(fā)生偽影。5’-標(biāo)簽化寡核苷酸在PCR反應(yīng)中的使用已有報(bào)道。然而，該擴(kuò)增方法的一個(gè)關(guān)鍵特征是它包括每個(gè)引物的退火和分離引物延伸反應(yīng)的步驟，并且因此不適合于實(shí)際的多重PCR概念。因此，為多重PCR創(chuàng)造完美的條件是一個(gè)非常困難和成本高昂的過(guò)程。因此，有必要開(kāi)發(fā)一種能夠在相同條件下同時(shí)同等程度擴(kuò)增若干個(gè)靶標(biāo)的多重PCR方法，無(wú)論不同引物的各特征如何。在這一技術(shù)背景下，本申請(qǐng)的諸位專利技術(shù)人已經(jīng)做出了大量努力來(lái)解決上述問(wèn)題，并且開(kāi)發(fā)了一種具有高檢測(cè)限和準(zhǔn)確度的用于檢測(cè)甲基化靶標(biāo)DNA的方法，并因此發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用通用引物連接的寡核苷酸通過(guò)非對(duì)稱線性擴(kuò)增來(lái)富集靶標(biāo)DNA且使用該富集的靶標(biāo)DNA作為模板來(lái)檢測(cè)靶標(biāo)DNA，并且將通用引物與靶標(biāo)特異性寡核苷酸連接時(shí)，即使與常規(guī)技術(shù)不同，僅添加一個(gè)引物用于靶標(biāo)DNA的多重檢測(cè)，也能夠以期望的高靈敏度和準(zhǔn)確度檢測(cè)甲基化DNA，從而完成本公開(kāi)內(nèi)容。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
技術(shù)問(wèn)題本公開(kāi)文本的一個(gè)目的是提供一種使用通用引物以多重方式檢測(cè)甲基化DNA的方法。本公開(kāi)文本的另一個(gè)目的是提供一種用于多重檢測(cè)甲基化DNA的組合物，其包含一種通用引物。本公開(kāi)文本的仍另一個(gè)目的是提供一種用于多重檢測(cè)甲基化DNA的試劑盒，其包含該組合物。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本公開(kāi)文本提供了一種用于檢測(cè)甲基化DNA的方法，其包括以下步驟：用于檢測(cè)甲基化DNA的方法，其包括：(a)用修飾非甲基化DNA位點(diǎn)以使其區(qū)分于甲基化DNA位點(diǎn)的至少一種試劑處理含靶標(biāo)DNA的樣品；(b)構(gòu)建寡核苷酸，其包含被設(shè)計(jì)為能夠與用該試劑處理的靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的靶標(biāo)特異性序列和不與靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的通用引物；(c)使用步驟(a)中用該試劑處理的靶標(biāo)DNA作為模板，并使用步驟(b)中構(gòu)建的該寡核苷酸作為引物，進(jìn)行單向非對(duì)稱線性擴(kuò)增；(d)使用能夠與步驟(c)中線性擴(kuò)增的DNA互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸和通用引物擴(kuò)增靶標(biāo)DNA；并且(e)通過(guò)能夠與步驟(d)中擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA序列互補(bǔ)雜交的探針檢測(cè)該靶標(biāo)DNA的甲基化。本公開(kāi)文本還提供了一種用于檢測(cè)甲基化DNA的組合物，其包含：至少一種用于處理含靶標(biāo)DNA樣品的試劑，該試劑修飾非甲基化DNA以使其區(qū)分于甲基化DNA；寡核苷酸，其包含能夠與用該試劑處理的靶標(biāo)DNA序列互補(bǔ)結(jié)合的靶標(biāo)特異性序列和不與靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的通用引物；能夠與線性擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸和通用引物；以及能夠與線性擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA序列互補(bǔ)雜交的探針。本公開(kāi)文本還提供了一種用于檢測(cè)甲基化DNA的試劑盒，其包含該組合物。附圖說(shuō)明圖1是示意性顯示用于多重檢測(cè)甲基化靶標(biāo)DNA的方法的概念圖。圖2顯示了本公開(kāi)文本的方法和常規(guī)方法之間甲基化DNA檢測(cè)靈敏度比較的結(jié)果。圖3示意性地顯示了設(shè)計(jì)用于靶標(biāo)DNA的引物和探針(在本公開(kāi)文本的方法中使用)的過(guò)程。圖4a和4b顯示了本公開(kāi)文本的方法(使用針對(duì)靶標(biāo)DNA的引物和探針進(jìn)行)和常規(guī)方法之間甲基化DNA檢測(cè)靈敏度比較的結(jié)果。具體實(shí)施方式除非另外定義，否則本文中使用的所有技術(shù)性和科學(xué)性術(shù)語(yǔ)具有與本專利技術(shù)所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同的含義。通常，本文使用的命名法和下文將描述的實(shí)驗(yàn)方法是本領(lǐng)域公知且常用的方法。在一方面，本公開(kāi)文本涉及一種用于檢測(cè)甲基化DNA的方法，其包括以下步驟：(a)用至少一種修飾非甲基化DNA位點(diǎn)以使其區(qū)分于甲基化DNA位點(diǎn)的試劑處理含靶標(biāo)DNA的樣品；(b)構(gòu)建寡核苷酸，其包含被設(shè)計(jì)為能夠與用該試劑處理的靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的靶標(biāo)特異性序列和不與靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的通用引物；(c)使用步驟(a)中用該試劑處理的靶標(biāo)DNA作為模本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種用于檢測(cè)甲基化DNA的方法，其包括：(a)用至少一種修飾非甲基化DNA位點(diǎn)以使其區(qū)分于甲基化DNA位點(diǎn)的試劑處理含靶標(biāo)DNA的樣品；(b)構(gòu)建寡核苷酸，其包含被設(shè)計(jì)為能夠與用該試劑處理的靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的靶標(biāo)特異性序列和不與該靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的通用引物；(c)使用步驟(a)中用該試劑處理的靶標(biāo)DNA作為模板，并使用步驟(b)中構(gòu)建的該寡核苷酸作為引物，進(jìn)行單向非對(duì)稱線性擴(kuò)增；(d)使用一種能夠與步驟(c)中線性擴(kuò)增的DNA互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸和一種通用引物來(lái)擴(kuò)增該靶標(biāo)DNA；并且(e)通過(guò)能夠與步驟(d)中擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA序列互補(bǔ)雜交的探針檢測(cè)該靶標(biāo)DNA的甲基化。

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】2016.10.06 KR 10-2016-01291101.一種用于檢測(cè)甲基化DNA的方法，其包括：(a)用至少一種修飾非甲基化DNA位點(diǎn)以使其區(qū)分于甲基化DNA位點(diǎn)的試劑處理含靶標(biāo)DNA的樣品；(b)構(gòu)建寡核苷酸，其包含被設(shè)計(jì)為能夠與用該試劑處理的靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的靶標(biāo)特異性序列和不與該靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的通用引物；(c)使用步驟(a)中用該試劑處理的靶標(biāo)DNA作為模板，并使用步驟(b)中構(gòu)建的該寡核苷酸作為引物，進(jìn)行單向非對(duì)稱線性擴(kuò)增；(d)使用一種能夠與步驟(c)中線性擴(kuò)增的DNA互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸和一種通用引物來(lái)擴(kuò)增該靶標(biāo)DNA；并且(e)通過(guò)能夠與步驟(d)中擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA序列互補(bǔ)雜交的探針檢測(cè)該靶標(biāo)DNA的甲基化。2.權(quán)利要求1的方法，其中該試劑為選自重亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、二亞硫酸鹽及其組合中的一種或多種。3.權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)用該試劑處理，將至少一個(gè)胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶或與胞嘧啶不同的另一種堿基。4.權(quán)利要求1的方法，其中檢測(cè)單個(gè)反應(yīng)器中樣品中的多個(gè)靶標(biāo)DNA甲基化。5.權(quán)利要求1的方法，其中該步驟(b)或(d)的該通用引物包含與選自由SEQIDNO:7和35至41表示的核苷酸序列的一個(gè)或多個(gè)序列具有至少50％同一性的序列。6.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)的該靶標(biāo)特異性序列與該靶標(biāo)DNA的甲基化位點(diǎn)和/或非甲基化位點(diǎn)互補(bǔ)結(jié)合。7.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)的該靶標(biāo)特異性序列包含一個(gè)或多個(gè)CpG二核苷酸。8.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)的該靶標(biāo)特異性序列包含與選自由SEQIDNO:2、5、9、14、17、21和26表示的序列的一個(gè)或多個(gè)序列具有至少50％同一性的序列。9.權(quán)利要求1的方法，其中甲基化的該檢測(cè)是通過(guò)選自以下的任一種方法進(jìn)行：PCR、甲基化特異性PCR、實(shí)時(shí)甲基化特異性PCR、使用甲基化DNA特異性結(jié)合蛋白的PCR、使用甲基化DNA特異性結(jié)合抗體的PCR、定量PCR、DNA芯片分析、測(cè)序、合成測(cè)序、以及連接測(cè)序。10.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(d)的該寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)CpG二核苷酸。11.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(d)的該寡核苷酸包含與選自由SEQIDNO:1、4、8、10至13、15、16、18至20、22至25、27和28表示的序列的一個(gè)或多個(gè)序列具有至少50％同一性的序列。12.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(e)的該探針包含一個(gè)或多個(gè)CpG二核苷酸。13.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(e)的該探針包含與選自由SEQIDNO:3、6、29、30和31...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：安城皖，吳泰禎，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：基因特力株式會(huì)社，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：韓國(guó),KR