用于檢測致病鮑特桿菌的寡核苷酸組合、方法及試劑盒技術

本發明專利技術涉及分子學生物檢測領域，更具體的，涉及鮑特桿菌檢測領域。本發明專利技術提供了一種寡核苷酸組合在制備檢測鮑特桿菌的試劑盒中的用途，其可特異性地檢測百日咳鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌、霍氏鮑特桿菌和支氣管敗血鮑特桿菌中的一種或更多種，與此同時，本發明專利技術還提供了所述寡核苷酸組合、包含所述寡核苷酸組合的試劑盒以及用于鑒定鮑特桿菌的方法。

Oligonucleotide combinations, methods and kits for detection of pathogenic Bauer's bacilli

【技術實現步驟摘要】
用于檢測致病鮑特桿菌的寡核苷酸組合、方法及試劑盒
本專利技術屬于分子學生物檢測領域，更具體的，屬于鮑特桿菌鑒定領域。
技術介紹
鮑特桿菌為革蘭陰性球桿菌，無芽胞，某些菌株有鞭毛，光滑型菌株有莢膜，是專性需氧型細菌，最適生長溫度為35～37℃，最適pH6.8～7.0，營養要求比較高。鮑特桿菌包括7個菌種，分別為百日咳鮑特桿菌(B.pertussis)、副百日咳鮑特桿菌(B.parapertussis)、支氣管敗血鮑特桿菌(B.branchiseptica)、鳥鮑特桿菌(B.avium)、欣氏鮑特桿菌(B.hinzii)、霍氏鮑特桿菌(B.holmesii)和創口鮑特桿菌(B.trematum)。百日咳鮑特桿菌能引起的一種嚴重急性呼吸道傳染病百日咳(pertussis)，傳染性較強，人群普遍易感，其中尤以嬰幼兒多見，是嚴重威脅人類健康的主要傳染病之一；副百日咳鮑特桿菌是與百日咳鮑特桿菌引起的癥狀類似，只是相對較輕；霍氏鮑特桿菌是一種能夠引起敗血癥、心肌炎、呼吸道疾病，尤其對于免疫缺陷的患者更易感染(例如：免疫功能不全者、艾滋病患者)。而支氣管敗血鮑特桿菌在一般情況下感染動物，但少數情況也能感染人，感染之后引起敗血癥、腦膜炎、肺炎等，而其易與其它細菌感染的癥狀混淆，因此，臨床上容易遺漏支氣管敗血鮑特桿菌的檢測。目前，主要利用細菌學、血清學檢測以及PCR技術來對鮑特桿菌進行檢測。細菌學檢測實驗周期太長，靈敏度低，只有15％～30％，方法也不易標準化；因此，其僅適合病程早期的診斷，遠不能滿足臨床需要。血清學檢測靈敏度不高，存在一定的假陽性且操作比較繁瑣，對操作人員要求較高。PCR檢測，特別是熒光定量PCR檢測是近年來發展迅速的一種核酸檢測技術，其特異性好，靈敏度高，且實驗周期短。中國專利公開CN109153699A披露了一種檢測鮑特桿菌的方法，通過三對引物實現了對百日咳鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌和霍氏鮑特桿菌的檢測。由于需要使用三對引物，檢測的操作更加復雜且不可避免地增加了檢測成本。另外，美國專利公開US2010/0221715A1也披露了一種檢測鮑特桿菌的組合物，其包括兩對引物，能夠檢測百日咳鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌和霍氏鮑特桿菌，但無法檢測出其他鮑特桿菌，如支氣管敗血鮑特桿菌，的存在。因此，現有技術存在對用盡量少的引物檢測盡量多的鮑特桿菌的高靈敏度試劑的強烈需求。
技術實現思路
有鑒于此，在第一方面，本專利技術提供了一種寡核苷酸組合在制備檢測鮑特桿菌的試劑盒中的用途，所述鮑特桿菌為選自百日咳鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌、霍氏鮑特桿菌和支氣管敗血鮑特桿菌中的一種或更多種，所述寡核苷酸組合包括：第一上游引物、第一下游引物、第一探針、第二上游引物、第二下游引物、和第二探針。在一個實施方式中，第一上游引物具有SEQIDNO:1所示的序列，第一下游引物具有SEQIDNO:2所示的序列，第一探針具有SEQIDNO:3所示的序列，第二上游引物具有SEQIDNO:4所示的序列，第二下游引物具有SEQIDNO:5所示的序列，第二探針具有SEQIDNO:6所示的序列。在另一個實施方式中，第一上游引物具有SEQIDNO:10所示的序列，第一下游引物具有SEQIDNO:11所示的序列，第一探針具有SEQIDNO:12所示的序列，第二上游引物具有SEQIDNO:4所示的序列，第二下游引物具有SEQIDNO:13所示的序列，第二探針具有SEQIDNO:6所示的序列。使用該寡核苷酸組合，可以同時檢測出樣品中所存在的百日咳鮑特桿菌、支氣管敗血鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌、霍氏鮑特桿菌中的一種或更多種，從而判斷受試者是否感染有百日咳鮑特桿菌、支氣管敗血鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌或霍氏鮑特桿菌，以及是否存在復合感染。百日咳鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌與支氣管敗血鮑特桿菌是公認的鮑特菌屬中被認為對人類有較大危害的3種菌；另外，近期發表的文獻表明：霍氏鮑特菌會造成與百日咳鮑特菌相似的癥狀。因此，如果能同時對上述4種鮑特桿菌進行檢測，則覆蓋范圍將更廣，不容易造成漏檢；同時還意味著全面地檢測了感染人類的常見鮑特桿菌。另一方面，本專利技術的用于檢測的寡核苷酸組合可以僅包括兩套引物和探針組，因而操作更加容易并節約了成本。在優選的實施方式中，所述本專利技術中的寡核苷酸組合還包括：用作內標檢測的寡核苷酸組合。具體地，用作內標檢測的寡核苷酸組合可包括內標上游引物、內標下游引物和內標探針。在一個實施方式中，內標上游引物具有SEQIDNO:7所示的序列，內標下游引物具有SEQIDNO:8所示的序列，內標探針具有SEQIDNO:9所示的序列。在另一個實施方式中，內標上游引物具有SEQIDNO:14所示的序列，內標下游引物具有SEQIDNO:15所示的序列，內標探針具有SEQIDNO:16所示的序列。也就是說，本專利技術的寡核苷酸組合可進一步包括內標引物以及內標探針。其可與本專利技術的寡核苷酸組合中的其它引物和探針聯用且互不影響。內標引物和探針的使用能夠判斷本次檢測是否有效，進一步確保所述寡核苷酸組合的檢測準確性。在本專利技術中，寡核苷酸組合可攜帶有用于實時熒光PCR檢測的熒光報告基團和淬滅基團。在一些實施方式中，本專利技術的寡核苷酸組合中第一探針和第二探針上的熒光報告基團可互不干涉地選自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE。優選地，第一探針和第二探針的熒光報告基團為FAM，內標探針的熒光報告基團為HEX。在一些實施方式中，本專利技術的寡核苷酸組合中第一探針和第二探針上的熒光猝滅基團可互不干涉地選自BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB-λ、Dabcyl-λ、TAMRA。優選地，第一探針、第二探針和內標探針的熒光猝滅基團為BHQ1。在第二方面，本專利技術還提供了一種寡核苷酸組合，其包括：第一上游引物：5’-TGGTGCGCTACGAGCATCA-3’(SEQIDNO:1)，第一下游引物：5’-GGATGTCGGTGAAGGCCAC-3’(SEQIDNO:2)，第一探針：5’-ACCGACGCGATACCGTTGAGGGG-3’(SEQIDNO:3)，第二上游引物：5’-CCGCTGCTGACGGTCTATGT-3’(SEQIDNO:4)，第二下游引物：5’-GCAAGACAAGCCTGGAACCAC-3’(SEQIDNO:5)，和第二探針：5’-CTGCGTGACGAACTCAAACGGCTCT-3’(SEQIDNO:6)；或者，第一上游引物：5’-CTGCTGCACATCGACATCAAGA-3’(SEQIDNO:10)，第一下游引物：5’-CAACGGTATCGCGTCGGTT-3’(SEQIDNO:11)，第一探針：5’-CTGGGACGTATCCAGCGCCCT-3’(SEQIDNO:12)，第二上游引物：5’-CCGCTGCTGACGGTCTATGT-3’(SEQIDNO:4)，第二下游引物：5’-CCGCTTGATGACCTTGATAGTG-3’(SEQIDNO:13)，和第二探針：5’-CTGCGTGACGAACTCAAACGGCTCT-3’(SEQIDNO:6)。在優選的實施方式中，所述寡核苷酸組合還包括：內標上游引物：5’-GACTC本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種寡核苷酸組合在制備檢測鮑特桿菌的試劑盒中的用途，所述鮑特桿菌為選自百日咳鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌、霍氏鮑特桿菌和支氣管敗血鮑特桿菌中的一種或更多種，所述寡核苷酸組合包括：由SEQ?ID?NO:1至6所示的寡核苷酸。

【技術特征摘要】
1.一種寡核苷酸組合在制備檢測鮑特桿菌的試劑盒中的用途，所述鮑特桿菌為選自百日咳鮑特桿菌、副百日咳鮑特桿菌、霍氏鮑特桿菌和支氣管敗血鮑特桿菌中的一種或更多種，所述寡核苷酸組合包括：由SEQIDNO:1至6所示的寡核苷酸。2.根據權利要求1所述的用途，其中，所述寡核苷酸組合還包括：由SEQIDNO:7至9所示的寡核苷酸。3.根據權利要求1或2所述的用途，其中，所述寡核苷酸組合的熒光報告基團互不干涉地選自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE。4.根據權利要求3所述的用途，其中，所述寡核苷酸組合中SEQIDNO:3和6的熒光報告基團相同；優選的，SEQIDNO:3和6的熒光報告基團為FAM，SEQIDNO:9的熒光報告基團為HEX。5....

【專利技術屬性】
技術研發人員：戴立忠，鄧中平，范文洲，紀博知，賴之洲，湯睿，
申請(專利權)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：湖南,43