用于檢測柯薩奇病毒A4型的試劑組合制造技術

本發明專利技術涉及用于檢測柯薩奇病毒A4型的試劑組合，其包括：上游引物：5'?ACATCCACCATACAGAGGGTCA?3'；下游引物：5'?GCTGTAGACGAAGCTCCT?3'；和探針：5'?CAACAGCCGCCAACACCAC?3'。本發明專利技術提供了一種能夠檢測CA4的試劑組合，并達到較高的檢測靈敏度。本發明專利技術還涉及該試劑組合在制備試劑盒中的用途；以及試劑盒。

Combination of reagents for detection of coxsackievirus A4

【技術實現步驟摘要】
用于檢測柯薩奇病毒A4型的試劑組合
本專利技術涉及體外診斷領域，具體涉及一種用于檢測柯薩奇病毒A4型的試劑組合。
技術介紹
柯薩奇病毒(Coxsackievirus，CV)最初于1948年由Dolldorf和Sickles在美國紐約州Coxsackie鎮從臨床診斷為脊髓灰質炎的患兒糞便中分離出來。柯薩奇病毒一種常見腸道病毒(Enterovirus)，分為A、B兩組，其中A組病毒有24個血清型(A1～A24)，而B組病毒有6個血清型(B1～B6)。臨床上，柯薩奇病毒感染診斷與分類的方法通常包括病毒培養、免疫學檢驗和核酸檢測。其中，實時熒光定量PCR技術是近年來發展迅速的一種核酸檢測技術，該技術使用帶有熒光檢測裝置的PCR擴增儀，熒光檢測裝置能夠按照一定的程序周期性地發出特定波長的激發光，收集檢測熒光信號，通過檢測熒光信號的動態變化實時反映PCR的每個循環的擴增水平，試驗結束后可通過軟件自動分析獲得擴增曲線，根據擴增曲線與熒光閾值線的交點(即Ct值)以及擴增曲線的形狀，可以判斷陰陽性結果。目前，對于柯薩奇病毒的一些常見血清型，如A6、A16型，已持續地進行了研究；針對它們的各自特點，研究者已設計出一些用于體外診斷的熒光定量PCR引物對和/或探針；它們中的一部分已經商業化并應用于基于實時熒光定量RCR的臨床檢測中。然而，由于此前柯薩奇病毒A4型的關注較少，其相對于A6、A16等血清型來說并不是研究熱點，相關的報道寥寥；值得一提的是，國內尚無基于實時熒光定量PCR技術定量檢測柯薩奇病毒A4型的商業化試劑盒?？滤_奇病毒A組4型(CA4)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬成員，是導致手足口病發病的常見病原體。CA4在1950年首次出現在美國，1998年發展為肯尼亞株(GQ176232)、亞洲株(2008日本株AB457644)和亞洲歐洲株(GⅡ-A)3種基因型別。文獻資料報道顯示CA4感染還可引起急性遲緩性麻痹、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎等多種疾病。近年來手足口病病原譜發生變化，非EV71和非CA16病毒感染引起手足口病比例有所增加，其中CA4感染占腸道病毒感染病例數的構成比約為1％。已經有多個地區爆發了由CA4病毒感染引起的手足口病疫情，研究顯示我國廣州地區目前的CA4流行株也是主要流行株，是由原始株發生了明顯的基因變化而快速產生的流行毒株。然而，國內外目前對CVA4的研究較少，且多限于對病毒株的分離和鑒定。繼而，基于熒光定量PCR的柯薩奇病毒A4型檢測試劑盒逐漸受到了關注。就這方面來說，中國專利公開CN102816869A提供了一組用于柯薩奇病毒A4實時熒光PCR檢測引物和探針，其能夠在25μl體系下檢測50拷貝的CA4，即檢測靈敏度為2000拷貝/mL。而對于CA4拷貝數較低的情況，該引物和探針組合則難以實現有效檢測。因此，在本領域中，存在著其他CA4熒光PCR檢測試劑，尤其是具有較高檢測靈敏度的檢測試劑的強烈需求。
技術實現思路
如前所述，如何基于熒光定量PCR的報道檢測柯薩奇病毒A4型的問題已逐漸引起了人們的關注。而值得一提的是，由于對CA4檢測的研究目前仍處于初期階段，相關投入熱度以及文獻報道量均處于較低水平，因此在研發過程中所能借鑒參考的資料非常有限；相對于其他熱門的血清型來說，這無疑給A4型檢測的研究工作帶來了更多困難。在大量工作的基礎上，本專利技術提供一種基于熒光PCR的柯薩奇病毒A4型檢測試；所述試劑組合可用于與柯薩奇病毒A4型的檢測相關的用途，所述試劑組合包括：CA4F1上游引物：5'-ACATCCACCATACAGAGGGTCA-3'(SEQIDNo.1)；CA4R1下游引物：5'-GCTGTAGACGAAGCTCCT-3'(SEQIDNo.2)；和CA4P1探針：5'-CAACAGCCGCCAACACCAC-3'(SEQIDNo.3)。在具體的實施方式中，CA4F1與CA4R1可分別以0.1μmol/L～0.5μmol/L的濃度存在；CA4P1可以0.1μmol/L～0.5μmol/L的濃度存在。在具體的實施方式中，所述試劑組合用于柯薩奇病毒A4型的熒光定量PCR檢測。在具體的實施方式中，所述探針的兩端分別標記有報告熒光基團和淬滅熒光基團。例如，所述探針的5'端可標記有報告熒光基團，而3'端可標記有淬滅熒光基團。示例性的報告熒光基團可以是CY5、CalRed610、FAM、HEX、JOE、ROX、TET、TEXASRED和VIC等。示例性的熒光淬滅基團可以是BHQ1、BHQ2、BHQ3、Eclipse、TAMRA等。在優選的實施方式中，所述報告熒光基團為FAM。在優選的實施方式中，所述熒光淬滅基團為BHQ1。除上述引物與探針外，本專利技術的試劑組合還可以包括用于進行熒光定量PCR的其它反應試劑，如PCR反應緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、mMLV酶、TaqDNA聚合酶、陽性對照或陰性對照等。在具體的實施方式中，陽性對照可為已知濃度的假病毒。在具體的實施方式中，陰性對照可為滅菌生理鹽水。在優選的實施方式中，為了預防由于樣本中可能存在的PCR干擾物質導致的假陰性防止檢測結果出現假陰性、監控反應體系是否有效，本專利技術的試劑組合可額外提供有內標監控系統。具體地，所述內標監控系統可包括內標模板、內標上游引物、內標下游引物和內標探針。在一個具體的實施方式中內標模板為為插入pUC18T載體的一段長為110堿基對的人工合成DNA序列的重組體，濃度為5.00E+03拷貝/ml～5.00E+05拷貝/ml，序列如下所示：5’-ACCGAAAGGCTATCATTATGGCTCCAGTTCCTCGTTAATTCTCGATTCCGAGTACTTTAAAGGGGCTTCTGGTCGACTACGTACGCTCTCTTCTACTTCGAGTACGACAG-3’(SEQIDNo.4)；內標上游引物為IC-F：5’-ACCGAAAGGCTATCATT-3’(SEQIDNo.5)；內標下游引物為IC-R：5’-CTGTCGTACTCGAAGTA-3’(SEQIDNo.6)；和內標探針為IC-P：5’-GGCTCCAGTTCCTCGTTAATT-3’(SEQIDNo.7)。在具體的實施方式中，內標上游引物與內標下游引物可分別以0.1μmol/L～0.4μmol/L的濃度存在；內標探針可以0.1μmol/L～0.4μmol/L的濃度存在。類似地，所述內標探針的兩端可分別標記有報告熒光基團和淬滅熒光基團。示例性的報告熒光基團可以是CY5、CalRed610、FAM、HEX、JOE、ROX、TET、TEXASRED和VIC等。示例性的熒光淬滅基團可以是BHQ1、BHQ2、BHQ3、Eclipse、TAMRA等。優選的，所述內標探針與檢測把多核苷酸的探針具有不同的報告熒光基團。優選的，所述內標探針與檢測把多核苷酸的探針具有相同的報告熒光基團。在優選的實施方式中，內標探針的報告熒光基團可為HEX，內標探針的熒光淬滅基團可為BHQ1。在一些實施方式中，本專利技術的試劑組合還可包括用于從樣本中提取和/或純化柯薩奇病毒A4型RNA的試劑。示例性的提取或純化方法可包括煮沸法、離心柱法、磁珠法。在優選的實施方式中，本專利技術的試劑組合包括使用磁珠法提取或純化RNA的相本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種試劑組合，其用于與柯薩奇病毒A4型的檢測相關的用途，所述試劑組合包括：上游引物：5'?ACATCCACCATACAGAGGGTCA?3'；下游引物：5'?GCTGTAGACGAAGCTCCT?3'；和探針：5'?CAACAGCCGCCAACACCAC?3'。

【技術特征摘要】
1.一種試劑組合，其用于與柯薩奇病毒A4型的檢測相關的用途，所述試劑組合包括：上游引物：5'-ACATCCACCATACAGAGGGTCA-3'；下游引物：5'-GCTGTAGACGAAGCTCCT-3'；和探針：5'-CAACAGCCGCCAACACCAC-3'。2.根據權利要求1所述的試劑組合，所述試劑組合用于柯薩奇病毒A4型的熒光定量PCR檢測。3.根據權利要求1或2所述的試劑組合，所述探針的兩端分別標記有報告熒光基團和淬滅熒光基團。4.根據權利要求3所述的試劑組合，所述報告熒光基團選自由CY5、CalRed610、FAM、HEX、JOE、ROX、TET、TEXASRED和VIC組成的組，優選為FAM；所述淬滅熒光基團選自由BHQ1、BHQ2、BHQ3、Eclipse和TAMRA組成的組，優選為BHQ1。5.根據權利要求1所述的...

【專利技術屬性】
技術研發人員：黃河，易曉明，王鐵軍，易麗媛，鄧中平，劉佳，戴立忠，
申請(專利權)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：湖南,43