本發明專利技術提供了一種Bt抗蟲基因JBT?FB，對Cry1Ac和Cry4Aa基因進行全面改造融合，得到如SEQ?ID?No：1所示的JBT?FB抗蟲基因。構建到含有強啟動子35S的植物表達載體上，通過農桿菌介導的遺傳轉化方法將JBT?FB基因轉到玉米基因組中，得到含有JBT?FB的轉基因玉米植株。研究證明本發明專利技術設計合成的Bt抗蟲基因JBT?FB能在玉米中穩定表達，轉基因玉米對玉米螟有顯著的抗性。
A synthesized Bt insect-resistant gene JBT-FB and its application
【技術實現步驟摘要】
一種人工設計合成的Bt抗蟲基因JBT-FB及其應用
本專利技術屬于基因改造和分子生物學領域，具體涉及一種人工設計合成的Bt抗蟲基因JBT-FB及其應用。
技術介紹
玉米是世界上三大糧食作物之一，是我國主要的糧食作物與經濟作物，其對保持農業結構穩定乃至糧食安全具有重要作用。玉米螟OstriniafurnacalisGuenée危害玉米植株地上的各個部位，使受害部分喪失功能，降低籽粒產量，是限制玉米產量提升的重要因素，由于其具有發生代數不穩定，鉆蛀能力強，藥劑不易到達取食位置，抗藥性較強等特點，化學方法對玉米螟的防治效果并不理想。同時，現有玉米種質缺少抗蟲資源，傳統抗性育種途徑亦很難取得突破。基因工程技術基因工程可將殺蟲基因轉化入玉米，從而獲得新的抗蟲玉米品種。但是隨著轉基因抗蟲玉米種植規模不斷擴大，轉基因抗蟲玉米仍然存在很多問題。抗蟲范圍相對較小，而危害玉米的害蟲極多，玉米害蟲逐漸對抗蟲玉米產生抗性。1901年日本生物學家ShigetaneIshiwatari首次在患猝倒病的家蠶幼蟲中分離出了蘇云金芽孢桿菌，并將其命名為Bacillussotto。德國科學家ErnstBerliner在德國蘇云金，從患病的地中海粉螟(Ephestiakuehniella)中也分離到了相同的細菌，將其命名為Bacillusthuringiensis。蘇云金芽胞桿菌，簡稱是一種革蘭氏陽性菌，屬于原核生物細菌綱芽胞桿菌科芽胞桿菌屬，廣泛存在于土壤、水域、植物、昆蟲尸體中。1953年，第一次發現蘇云金芽胞桿菌的殺蟲活性與伴胞晶體有關，伴胞晶體對多種昆蟲尤其是鱗翅目的幼蟲有毒殺作用，蟲吃后可破壞蟲體腸道，因而是一種微生物農藥，可以用于生產生物殺蟲劑，伴胞晶體被昆蟲吞食后在昆蟲腸液的堿性條件下水解、激活后，最終形成有活性的毒性肽。Cry蛋白家族的三維結構典型特征是含有明顯能區分出來的三個Domain，即DomainI、DomainII、DomainIII。DomainI由7個α螺旋組成，是殺蟲蛋白發揮功能的主要區域，參與了殺蟲蛋白低聚物形成和插入細胞膜形成穿孔導致細胞死亡的過程，DomainII由β折疊組成3個loop環，主要參與殺蟲蛋白與受體結合。DomainIII由β折疊組成輪狀拓補結構，主要參與殺蟲蛋白與受體的識別，是不同BtCry蛋白識別不同害蟲的主要功能區域，DomainII和DomainIII共同決定靶標害蟲的類型。抗蟲基因具有遺傳穩定，對昆蟲幼蟲特別有效，對人畜無毒，不破壞環境，抗性持久。但由于抗蟲基因也存在著一些缺點，如長時間轉基因植物的種植，導致害蟲產生抗藥性基因的抗蟲譜一般較窄，而自然界的害蟲種類繁多。因此，尋找新的抗蟲基因來提高殺蟲率和擴大抗蟲譜是目前急需解決的問題。本專利技術將創造新的抗蟲基因，為轉基因抗蟲玉米的培育儲備有用的基因，將對抗蟲基因結構與功能的理論研究打下良好的基礎。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術的不足，提供一種人工合成的Bt抗蟲基因JBT-FB。本專利技術的第二個目的是提供人工合成的Bt抗蟲基因JBT-FB在制備抗蟲植物中的應用。本專利技術的技術方案概述如下：一種人工合成的Bt抗蟲基因JBT-FB，所述Bt抗蟲基因JBT-FB的核苷酸序列用SEQIDNo1所示。上述的人工合成的Bt抗蟲基因JBT-FB在制備抗蟲植物中的應用。本專利技術的優點：人工合成的Bt抗蟲基因JBT-FB較其密碼子優化前更容易獲得高表達的轉基因植株。該基因可在轉基因玉米中穩定遺傳和表達，且表達量高，所得轉基因玉米抗蟲性好。附圖說明圖1.JBT-FB基因設計過程圖2.JBT-FB基因的植物表達載體圖3.轉JBT-FB基因的玉米RT-PCR檢測結果具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本專利技術，但并不限定本專利技術。下述實施例中所用方法如果沒有特別的說明，均為常規方法，所用術語和縮寫均是本領域技術人員通用的術語和縮寫。C58農桿菌感受態購自武漢淼靈生物科技有限公司；含有基因Bar的質粒pCAMBIA3301購自武漢淼靈生物科技有限公司。實施例1JBT-FB基因的設計改造本專利技術是在蘇云金芽孢桿菌中所發現的對鱗翅目害蟲有特異殺蟲活性的殺蟲晶體蛋白基礎上，根據蘇云金芽孢桿菌Cry1Ac蛋白和Cry4Aa不同區域的活性分析及玉米基因組特點，我們對兩種蛋白對應的密碼子及編碼框進行了優化改造，分別命名為Cry1Ac-J和Cry4Aa-J。接著將Cry1Ac-J的DomainII和DomainIII與Cry4Aa-J的DomainI進行融合(見圖1)，獲得一條新的基因，命名為JBT-FB。基因序列如SEQIDNo：1所示。實施例2JBT-FB基因的植物表達載體構建按照實施例1的方案我們設計合成了JBT-FB基因，同時在基因的5’端添加了BamHI的酶切位點，3’端添加了SalI的酶切位點。用BamHI、SalI對JBT-FB基因進行酶切，并回收JBT-FB基因片段，然后與BamHI、SalI酶切過得的已有植物表達載體pCambia3301進行連接，得到含有JBT-FB基因的植物表達載體pCAMBIA3301-JBT-FB(見圖2)。實施例3抗蟲基因JBT-FB轉化農桿菌。實驗中所用的農桿菌為C58菌株，重組質粒載體pCAMBIA3301-JBT-FB上構建有篩選基因Bar。將保存的C58農桿菌感受態從-80℃冰箱拿出100μL，放在冰上，取出3μLpCAMBIA3301-JBT-FB質粒與農桿菌100μL混勻，冰浴15min，放入冰上預冷的電擊杯中，1500V，電擊轉化。將菌液吸入1.5mL離心管中，加入400μLYEP液體培養基，于28℃振蕩培養3h，6000r/min，28℃，離心收集菌體，棄300μL上清，重懸菌體，涂板于28℃暗培養2天，篩選出轉化成功的轉化用農桿菌菌株。實施例4農桿菌侵染液的制備從平板上挑取轉化用農桿菌單菌落接種于YEP液體培養基中(含100mg/L卡那霉素)，28℃、180r/min振蕩培養過夜，當農桿菌生長至對數生長期時(OD600為0.6，20℃，5000r/min離心7min收集菌體，用等體積侵染培養基重懸菌體，得到農桿菌侵染液。YEP培養基：10g/L蛋白胨+10g/L酵母提取物+5g/LNaCl，pH為7.0。侵染培養基：1/2MS+65g/L蔗糖+36.5g/L葡萄糖+150μmol/L乙酰丁香酮，pH為5.3。實施例5轉抗蟲基因JBT-FB玉米的獲得。1玉米芽尖的轉化。選取整齊飽滿的玉米種子，70％酒精浸泡1min，0.1％升汞消毒12min，無菌水清洗3次后接入發芽培養基，26℃，黑暗條件下培養。待苗長至4-6cm時，在無菌條件下切除幼葉和胚芽鞘以露出芽尖生長點，并用滅過菌的手術刀輕輕劃傷用于侵染。將玉米芽尖浸泡在侵染培養基中(含有150μmol/L乙酰丁香酮)并置于真空干燥器中，在50kPa壓力下分別侵染20分鐘，侵染完后棄去菌液，用無菌濾紙吸去玉米芽尖表面多余的菌液，繼續放入發芽培養基中共培養3天。發芽培養基：1/2MS+30g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂，pH為5.7。2轉化苗的移栽和篩選。洗去玉米小苗表面的培養基，移入裝有珍珠巖和蛭石的花盆中，放于溫室培養。待小苗長到5-7cm時將草胺膦溶液噴灑在本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種人工合成的Bt抗蟲基因JBT?FB，其特征是所述Bt抗蟲基因JBT?FB的核苷酸序列用SEQ?ID?No?1所示。
【技術特征摘要】
1.一種人工合成的Bt抗蟲基因JBT-FB，其特征是所述Bt抗蟲基因JBT-FB的核苷酸序列用...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王昱蓉，季靜，李倩，
申請(專利權)人：天津市天大天福生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：天津,12
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