一種γδT-NK細(xì)胞共培養(yǎng)的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種γδT?NK細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，具體涉及γδT細(xì)胞和NK細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)擴(kuò)增的方法，先通過刺激誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增為γδT細(xì)胞，同時(shí)通過采集外周血分離篩選并刺激誘導(dǎo)擴(kuò)增出NK細(xì)胞，后通過γδT細(xì)胞與NK細(xì)胞共同誘導(dǎo)活化培養(yǎng)，同時(shí)利用多種擴(kuò)增因子組合共同刺激誘導(dǎo)擴(kuò)增γδT細(xì)胞與NK細(xì)胞，獲得的混合細(xì)胞具有數(shù)量大、擴(kuò)增倍數(shù)高、細(xì)胞毒性強(qiáng)等特點(diǎn)，具有非常好的臨床應(yīng)用價(jià)值。且該共培養(yǎng)誘導(dǎo)擴(kuò)增方法提高細(xì)胞培養(yǎng)效率，縮短了培養(yǎng)時(shí)間，大幅度降低培養(yǎng)成本，也降低了培養(yǎng)技術(shù)難度，簡(jiǎn)化了在臨床中治療過程，簡(jiǎn)化了治療手段，也降低了治療成本。

A Co-culture Method of Gamma Delta T-NK Cells

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種γδT-NK細(xì)胞共培養(yǎng)的方法
：本專利技術(shù)涉及生物
，具體涉及γδT細(xì)胞和NK細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)擴(kuò)增的方法，及使用該方法獲得的γδT-NK細(xì)胞組合物。
技術(shù)介紹
：γδT細(xì)胞是一種既能殺傷癌細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，又能識(shí)別癌抗原的免疫細(xì)胞。γδT細(xì)胞是執(zhí)行固有免疫功能的T細(xì)胞，其TCR由γ和δ鏈組成。此類T細(xì)胞主要分布于腸道呼吸道以及泌尿生殖道等黏膜和皮下組織，在外周血中只占CD3+T細(xì)胞的0.5％-1％。其TCR缺乏多樣性，可直接識(shí)別某些完整的多肽抗原。γδT細(xì)胞所識(shí)別的抗原種類有限:①HSP；②感染細(xì)胞表面CD1分子提成的脂類抗原；③某些病毒蛋白或表達(dá)于感染細(xì)胞表面的病毒蛋白；④細(xì)菌裂解產(chǎn)物中的磷酸化抗原。γδT細(xì)胞是一種既能殺傷癌細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，又能識(shí)別癌抗原的免疫細(xì)胞，它的殺傷性較強(qiáng)，但腫瘤干細(xì)胞殺傷不如NK細(xì)胞。因此，它主要用于殺傷癌細(xì)胞與協(xié)助DC細(xì)胞識(shí)別發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞抗原，然后將這些抗原進(jìn)行殺傷或是傳遞給其他細(xì)胞。同時(shí)，γδT細(xì)胞主要分布于皮膚和黏膜組織上，因此對(duì)于黏膜方面的癌癥治療效果突出，比如消化道、呼吸道、生殖系統(tǒng)方面的癌癥效果顯著。γδT細(xì)胞主要在胸腺中發(fā)育成熟，通過V(D)J基因重組產(chǎn)生γδT細(xì)胞受體(TCR)。通過特異性的基因重排，從一個(gè)共同淋巴細(xì)胞前體(commonlymphoidprecursor,CLP)分化為表達(dá)αβ受體和γδ受體的T細(xì)胞系。γδT細(xì)胞不易受抗原加工和呈遞缺失的影響，因此γδT細(xì)胞具有很高的臨床腫瘤免疫治療潛在應(yīng)用價(jià)值。γδT細(xì)胞在腫瘤免疫監(jiān)視和抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。γδT細(xì)胞作用還體現(xiàn)在：①γδT細(xì)胞能夠與多種免疫細(xì)胞發(fā)生作用，參加抗腫瘤免疫應(yīng)答。②γδT細(xì)胞能夠在腫瘤發(fā)生的早期階段迅速引起有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。③γδT細(xì)胞在抗腫瘤免疫過程中具有重要的保護(hù)作用。④γδT能夠利用細(xì)胞毒效應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞，防止腫瘤的發(fā)生發(fā)展。⑤γδT細(xì)胞能夠分泌相關(guān)因子，這些因子能夠放大腫瘤信號(hào)。⑥γδT細(xì)胞能分泌穿孔素，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。由于γδT細(xì)胞在外周血中的含量極低，大大限制了γδT細(xì)胞作為過繼免疫細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用。目前從外周血單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增γδT細(xì)胞，擴(kuò)增倍數(shù)低，細(xì)胞純度及細(xì)胞量不高。擴(kuò)增出的γδT細(xì)胞很難滿足臨床需求，即使通過優(yōu)化各種誘導(dǎo)條件及擴(kuò)增方法擴(kuò)增出的單一γδT細(xì)胞在相應(yīng)的免疫性疾病和腫瘤疾病上有所應(yīng)用，但是應(yīng)用后并未達(dá)到人們理想中的效果。細(xì)胞免疫治療是目前最具有前景的腫瘤治療方式之一，通過體外擴(kuò)增或改造后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的或者通過活化機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)腫瘤患者自身免疫功能從而抵抗腫瘤或其他疾病。目前，NK細(xì)胞免疫治療受到越來越多的重視。NK細(xì)胞占人外周血淋巴細(xì)胞的5-15％，一般定義其表型為CD3-CD56+，NK細(xì)胞又可以進(jìn)一步細(xì)分為兩個(gè)主要的亞群：具有免疫調(diào)節(jié)功能的CD56highCD16-細(xì)胞和具有細(xì)胞毒活性的CD56dimCD16+細(xì)胞。NK細(xì)胞在抗病毒感染和抗腫瘤的早期免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的免疫監(jiān)視功能，NK細(xì)胞不需要識(shí)別腫瘤特異性抗原，便可直接、快速的發(fā)揮細(xì)胞毒活性。特別重要的是NK細(xì)胞能夠有效地清除機(jī)體內(nèi)的腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在現(xiàn)有的研究中，大多采用單一的免疫細(xì)胞或殺傷性細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療或者在臨床治療中采用聯(lián)合治療的方式，在現(xiàn)有技術(shù)中，采用聯(lián)合治療需要花費(fèi)更高的費(fèi)用，為病患帶來更多經(jīng)濟(jì)壓力。因此，專利技術(shù)一種實(shí)用高效、成本低、技術(shù)簡(jiǎn)單、可大量擴(kuò)增高數(shù)量、高細(xì)胞毒活性的γδT細(xì)胞和NK細(xì)胞，大量擴(kuò)增出免疫細(xì)胞，為眾多患者進(jìn)行細(xì)胞治療提供了原料來源，成為目前病患治療的一種希望。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對(duì)上述所述問題，本專利技術(shù)提出了一種γδT-NK細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，具體涉及γδT細(xì)胞和NK細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)擴(kuò)增的方法，先通過刺激誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增為γδT細(xì)胞，同時(shí)通過采集外周血分離篩選并刺激誘導(dǎo)擴(kuò)增出NK細(xì)胞，后通過γδT細(xì)胞與NK細(xì)胞共同誘導(dǎo)活化培養(yǎng)，同時(shí)利用多種擴(kuò)增因子組合共同刺激誘導(dǎo)擴(kuò)增γδT細(xì)胞與NK細(xì)胞，獲得γδT細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)混合細(xì)胞，具有數(shù)量大、擴(kuò)增倍數(shù)高、細(xì)胞毒性強(qiáng)等特點(diǎn)，具有非常好的臨床應(yīng)用價(jià)值。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用以下的技術(shù)方案：所述γδT-NK細(xì)胞共培養(yǎng)的方法包括以下步驟：1：γδT細(xì)胞的獲得；2：NK細(xì)胞的獲得；3：γδT細(xì)胞和NK細(xì)胞混合細(xì)胞物誘導(dǎo)擴(kuò)增共培養(yǎng)；4：15-20天γδT細(xì)胞和NK細(xì)胞混合細(xì)胞的獲得。其中所述γδT細(xì)胞的獲得包括如下步驟：(1)單個(gè)核細(xì)胞的制備：分離單個(gè)核細(xì)胞，用含體積百分比50％-100％的含10vt％FBS或自體血清的RMPI1640和0％-50％X-vivo15的混合培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋中培養(yǎng)；(2)γδT細(xì)胞的誘導(dǎo)：加入含濃度為1-100μM的唑來膦酸和500～3000U/mLIL-2的混合培養(yǎng)基體外刺激4天后加入含有10～500ng/mLanti-humanCD3Ab、10～500ng/mLanti-humanCD28Ab、10～200ng/mLIL-15、10～200ng/mLIL-21、500～3000U/mLIL-2的混合培養(yǎng)基進(jìn)行半量換液，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(3)培養(yǎng)2～3天，待γδT細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好待后續(xù)使用。優(yōu)選的，唑來膦酸濃度為5μM、anti-humanCD3Ab濃度為50ng/mL、anti-humanCD28Ab濃度為50ng/mL、IL-15濃度為50ng/mL、IL-21濃度為50ng/mL、IL-2濃度為1000U/mL。優(yōu)選的，單個(gè)核細(xì)胞來源于外周血、臍帶血、骨髓或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)。在一個(gè)實(shí)施方案中也可以使用其他磷酸抗原代替唑來膦酸，包括異戊烯焦磷酸酯(IPP),(E)-4-羥基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯(HMB-PP),焦磷酸乙酯(EPP)，焦磷酸法呢酯(FPP),二甲基烯丙基磷酸酯(DMAP),二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP),乙基-腺苷三磷酸酯(EPPPA)，牦牛兒焦磷酸酯(GPP),牦牛兒牦牛兒焦磷酸酯(GGPP),異戊烯-腺苷焦磷酸酯(IPPPA),磷酸一乙酯(MEP),焦磷酸一乙酯(MEPP)等含有氮的雙磷酸酯。優(yōu)選的，在一個(gè)實(shí)施案例中混合培養(yǎng)基中含10vt％FBS或自體血清的RMPI1640的比例為50vt％，X-vivo15培養(yǎng)基的比例為50vt％。其中NK細(xì)胞的獲得包括如下步驟：(1)分離單個(gè)核細(xì)胞；(2)通過免疫分選去除單個(gè)核細(xì)胞中的CD3+T淋巴細(xì)胞；(3)加入NK細(xì)胞培養(yǎng)用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基及終濃度為10-500ng/mlIL-15、10-500ng/mlIL-12、10-500ng/mlIL-21、10-500ng/mlIL-18和500-2000U/mlIL-2接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶體外培養(yǎng)2-5天后全換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。上述所述單個(gè)核細(xì)胞是通過肝素抗凝無菌一次性采血管靜脈穿刺采集外周血后，通過Ficoll密度梯度離心獲得或者通過單采機(jī)采集的單個(gè)核細(xì)胞；或者來自于臍帶血、骨髓和iPSCs誘導(dǎo)分化得到的單個(gè)核細(xì)胞。所述免疫分選去除單個(gè)核細(xì)胞中的CD3+T淋巴細(xì)胞可采用免疫磁珠、膜泡免疫分選和流式細(xì)胞儀免疫分選等方法。所述去除CD3本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種γδT?NK細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，其特征在于：γδT?NK細(xì)胞共培養(yǎng)的方法包括以下步驟：(1)γδT細(xì)胞的獲得；(2)NK細(xì)胞的獲得；(3)γδT細(xì)胞和NK細(xì)胞混合細(xì)胞物誘導(dǎo)擴(kuò)增共培養(yǎng)；(4)15?20天γδT細(xì)胞和NK細(xì)胞混合細(xì)胞的獲得。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種γδT-NK細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，其特征在于：γδT-NK細(xì)胞共培養(yǎng)的方法包括以下步驟：(1)γδT細(xì)胞的獲得；(2)NK細(xì)胞的獲得；(3)γδT細(xì)胞和NK細(xì)胞混合細(xì)胞物誘導(dǎo)擴(kuò)增共培養(yǎng)；(4)15-20天γδT細(xì)胞和NK細(xì)胞混合細(xì)胞的獲得。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述γδT-NK細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，其特征在于：γδT細(xì)胞的獲得方法為：(1)單個(gè)核細(xì)胞的制備：分離單個(gè)核細(xì)胞，用含體積百分比50％-100％的含10vt％FBS或自體血清的RMPI1640和0％-50％X-vivo15的混合培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋中培養(yǎng)；(2)γδT細(xì)胞的誘導(dǎo)：加入含濃度為1-100μM的唑來膦酸和500～3000U/mLIL-2的混合培養(yǎng)基體外刺激4天后加入含有10～500ng/mLanti-humanCD3Ab、10～500ng/mLanti-humanCD28Ab、10～200ng/mLIL-15、10～200ng/mLIL-21、500～3000U/mLIL-2的混合培養(yǎng)基進(jìn)行半量換液，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(3)培養(yǎng)2～3天，待γδT細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好待后續(xù)使用。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述γδT-NK細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，其特征在于：NK細(xì)胞的獲得包括如下步驟：(1)分離單個(gè)核細(xì)胞；(2)通過免疫分選去除單個(gè)核細(xì)胞中的CD3+T淋巴細(xì)胞；(3)加入NK細(xì)胞培養(yǎng)用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基及終濃度為10-500ng/mlIL-15、10-500ng/mlIL-12、10-500ng/mlIL-21、10-500ng/mlIL...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：邢永梅，鄧蒙蒙，程簫，劉丹，吳疆，王保如，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：安徽瑞達(dá)健康產(chǎn)業(yè)有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：安徽,34