工程化的異源二聚體蛋白質制造技術

本發明專利技術提供了異源二聚體抗體及其片段以及它們的制備方法，其中重鏈和輕鏈的配對得到改善。界面殘基發生突變，使得當兩條不同的重鏈和兩條不同的輕鏈在同一細胞中共轉染并共表達以組裝為功能性異源二聚體抗體或其片段時，每條輕鏈強烈偏向于其同源重鏈。

Engineering heterodimer protein

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】工程化的異源二聚體蛋白質序列表本申請含有已經以ASCII格式電子遞交的序列表，并且將該序列表通過援引以其整體特此并入。所述ASCII副本創建于2018年2月20日，名稱為PAT057505-WO-PCT_SL.txt并且大小為201,737字節。
本專利技術涉及包含促進正確的重鏈和輕鏈配對的修飾的異源二聚體抗體及其片段，以及它們的制備方法。
技術介紹
異源二聚體抗體(特別是作為人疾病的治療劑的雙特異性抗體)的施用具有巨大的臨床潛力，但異源二聚體抗體的穩健生成，尤其是純的且可開發的異源二聚體抗體的產生仍然具有挑戰性。抗體重鏈以混雜方式結合抗體輕鏈，使得給定的重鏈可以與λ和κ輕鏈類別的許多輕鏈序列配對(EdwardsBM等人,(2003)J.Mol.Biol.[分子生物學雜志]334:103-18)。先前的工作已經表明，重鏈和輕鏈的配對是隨機進行的(BrezinschekHP等人,(1998)J.Immunol.[免疫學雜志]160:4762-7)。作為這種結合的結果，兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈的伴隨表達自然導致重鏈-輕鏈配對的雜混；然而，同質配對是可制造性和生物功效的基本要求。異源二聚體抗體形式如DVD-Ig(WuC等人,(2007)Nat.Biotech.[自然生物技術]25(11):1290-7)、CrossMab(SchaeferW等人,(2011)PNAS[美國國家科學院院刊]108(27):11187-92)或“二合一”抗體(BostromJ等人,(2009)Science[科學]323(5921):1610-4)允許產生雙特異性抗體，但具有不同的缺陷。盡管存在這些近期發展，但本領域仍然需要具有正確的重鏈和輕鏈配對的改善的異源二聚體抗體形式，以及用于實現這種同質配對以避免生成錯配污染物的方法。
技術實現思路
在本專利技術中，為了改善異源二聚體抗體的重鏈和輕鏈的配對，應用靜電轉向機制對抗體和抗體片段的子集的重鏈和輕鏈進行工程化。界面殘基發生突變，使得當兩條不同的重鏈和兩條不同的輕鏈在同一細胞中共轉染并共表達以組裝為功能性異源二聚體雙特異性抗體時，每條輕鏈強烈偏向于其同源重鏈。用于對重鏈-輕鏈配對進行工程化的設計策略包括鑒定代表性Fab。代表性Fab的標準是它是常用的重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)亞組的成員，如VH3和Vκ1或Vλ1。對于電荷工程化，考慮幾個標準。所選氨基酸應不與構象結構中的可變結構域CDR接觸，因為與CDR的相互作用接觸可最終導致結合喪失，因此應避免。所選位置在大多數常見抗體家族內應是高度保守的，以便能夠生成任何給定亞家族的異源二聚體。另外，通過避免VH與VL，以及重鏈恒定結構域1(CH1)與輕鏈恒定結構域(CL)的界面中心的位置，并選擇該界面邊緣處的位置，可以通過在結構域的末端產生鹽橋并從而產生接近正確的重鏈-輕鏈形成的“夾持效應(clip-effect)”來實現強烈促進異源二聚體形成的效果。這種“夾持效應”用于穩定蛋白質并減少恒定結構域CH1和CL的界面的不穩定。因此，在VH和VL結構域的末端處以及CH1和CL結構域的起點和末端處引入帶電殘基。在CH1和CL結構域的末端處選擇用于電荷工程化的殘基是基于相應主鏈之間最多至的觀察距離，這與基于側鏈相互作用來選擇用于修飾的殘基截然不同。在一個方面，本專利技術提供了一種異源二聚體抗體或其片段，所述異源二聚體抗體或其片段包含在某些位置處包含多個取代的工程化的VH和CH1結構域以及工程化的VL和CL結構域。所有取代位置的編號均依照EU編號。在一個實施例中，本專利技術提供了一種異源二聚體抗體或其片段，所述異源二聚體抗體或其片段包含：在第39位、第147位和第165位包含帶電或中性氨基酸的工程化的VH結構域和CH1結構域；以及在第38位、第124位和第169/170位包含帶電或中性氨基酸(EU編號)的工程化的VL結構域和CL結構域，其中VH和CH1結構域中的所述氨基酸，以及VL和CL結構域中的界面的相應氨基酸成對地具有相反電荷或為帶電的/中性的，并形成在靜電方面有利于異源二聚化的界面。為了確保指定位置處的氨基酸具有適當的電荷(負電荷、正電荷或中性/不帶電)，可能必需用不同電荷的氨基酸取代野生型序列中特定位置處的氨基酸。例如，野生型序列中的氨基酸可以是中性的、堿性的或酸性的，并且取代導致電荷的變化。更具體地，中性氨基酸可被堿性或酸性氨基酸取代，堿性氨基酸可被中性或酸性氨基酸取代，或酸性氨基酸可被中性或堿性氨基酸取代。在一個實施例中，在VH結構域中，第39位的中性氨基酸谷氨酰胺(Q)可被堿性或酸性氨基酸取代。堿性氨基酸(正電荷)的示例包括精氨酸(R)、賴氨酸(K)或組氨酸(H)并且酸性氨基酸(負電荷)的示例包括天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。具體地，取代是從Q到R、K或D。在CH1結構域中，第147位的堿性氨基酸K可保持不變，即具有正電荷或可被中性或酸性氨基酸取代。具體地，取代是取代成酸性氨基酸并且是從K到D。此外，第165位的中性氨基酸絲氨酸(S)可保持不帶電，即，是中性的或可被堿性或酸性氨基酸取代。具體地，取代是從S到R或D。在一個實施例中，VH結構域來自VH1、VH2、VH3、VH5或VH6亞家族。在一個具體實施例中，VH結構域來自VH3亞家族。在其中輕鏈屬于κ(kappa)亞型的一個實施例中，在VL結構域中，第38位的中性氨基酸Q可被堿性或酸性氨基酸取代。堿性氨基酸的示例包括精氨酸(R)、賴氨酸(K)或組氨酸(H)并且酸性氨基酸的示例包括天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。具體地，取代是從Q到R、K或D。在CL結構域中，第124位的中性氨基酸Q可保持不帶電，即，是中性的或可被堿性或酸性氨基酸取代。具體地，取代是從Q到K或D。另外，第169位的堿性氨基酸K可保持不變，即具有正電荷或可被中性或酸性氨基酸取代，具體地講取代是取代成酸性氨基酸并且是從K到D。在一個實施例中，κ輕鏈屬于Vκ1或Vκ3亞家族。在其中輕鏈屬于λ(lambda)亞型的一個實施例中，在VL結構域中，第38位的中性氨基酸Q可被堿性或酸性氨基酸取代。堿性氨基酸的示例包括精氨酸(R)、賴氨酸(K)或組氨酸(H)并且酸性氨基酸的示例包括天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。具體地，取代是取代成堿性氨基酸并且是從Q到K。在CL結構域中，第124位的酸性氨基酸E可被中性、堿性或另一酸性氨基酸取代。具體地，取代是取代成另一酸性氨基酸并且是從E到D。此外，第170位的中性氨基酸N可保持不帶電，即，是中性的或可被堿性或酸性氨基酸取代。具體地，取代是取代成堿性氨基酸并且是從N到K或從N到R。在一個實施例中，λ輕鏈屬于Vλ1、Vλ2或Vλ3亞家族。在一個實施例中，工程化的VH和CH1結構域可在第39位、第147位和第165位包含帶電或中性氨基酸，并且工程化的VL和CL結構域可在界面的相應的第38位、第124位和第169/170位包含帶電或中性氨基酸(EU編號)。因此，本專利技術提供了一種具有工程化的VH和CH1結構域以及工程化的VL和CL結構域的異源二聚體抗體或其片段，其中：(i)工程化的VH和CH1結構域在第39位包含酸性氨基酸、在第147位包含酸性氨基酸并且在第165位包含酸性氨基酸，并且工程化的VL本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種異源二聚體抗體或其片段，所述異源二聚體抗體或其片段包含至少兩個Fab，其中至少一個Fab包含：(a)在第39位、第147位包含帶電氨基酸并且在第165位包含帶電或中性氨基酸(EU編號)的工程化的重鏈可變結構域(VH)和恒定結構域1(CH1)；以及(b)在第38位包含帶電氨基酸并且在第124位和第169/170位包含帶電或中性氨基酸(EU編號)的工程化的輕鏈可變結構域(VL)和恒定結構域(CL)，其中所述VH和CH1結構域以及所述VL和CL結構域中的所述氨基酸成對地具有相反電荷或為帶電的/中性的，并且相對應以形成在靜電方面有利于異源二聚化的界面。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2017.03.02 US 62/465,9371.一種異源二聚體抗體或其片段，所述異源二聚體抗體或其片段包含至少兩個Fab，其中至少一個Fab包含：(a)在第39位、第147位包含帶電氨基酸并且在第165位包含帶電或中性氨基酸(EU編號)的工程化的重鏈可變結構域(VH)和恒定結構域1(CH1)；以及(b)在第38位包含帶電氨基酸并且在第124位和第169/170位包含帶電或中性氨基酸(EU編號)的工程化的輕鏈可變結構域(VL)和恒定結構域(CL)，其中所述VH和CH1結構域以及所述VL和CL結構域中的所述氨基酸成對地具有相反電荷或為帶電的/中性的，并且相對應以形成在靜電方面有利于異源二聚化的界面。2.如權利要求1所述的異源二聚體抗體或其片段，其中如通過液相色譜-質譜法所確定，實現至少95％的異源二聚化。3.如權利要求1或權利要求2所述的異源二聚體抗體或其片段，其中所述工程化的VH和CH1結構域在第39位包含酸性氨基酸、在第147位包含堿性氨基酸并且在第165位包含酸性氨基酸，并且其中所述工程化的VL和CL結構域在第38位包含堿性氨基酸、在第124位包含酸性氨基酸并且在第169/170位包含堿性氨基酸。4.如權利要求1或權利要求2所述的異源二聚體抗體或其片段，其中所述工程化的VH和CH1結構域在第39位包含堿性氨基酸、在第147位包含酸性氨基酸并且在第165位包含堿性氨基酸，并且其中所述工程化的VL和CL結構域在第38位包含酸性氨基酸、在第124位包含堿性氨基酸并且在第169/170位包含酸性氨基酸。5.如前述權利要求中任一項所述的異源二聚體抗體或其片段，其中所述工程化的重鏈可變結構域屬于VH1、VH2、VH3、VH5或VH6亞型。6.如前述權利要求中任一項所述的異源二聚體抗體或其片段，其中所述工程化的輕鏈可變結構域屬于Vκ1或Vκ3亞家族并且在第38位、第124位和第169位包含帶電氨基酸。7.如權利要求1-5中任一項所述的異源二聚體抗體或其片段，其中所述工程化的輕鏈可變結構域屬于Vλ1、Vλ2或Vλ3亞家族并且在第38位、第124位和第170位包含帶電氨基酸。8.如前述權利要求中任一項所述的異源二聚體抗體或其片段，包含屬于Vκ1或Vκ3亞家族的工程化的輕鏈可變結構域和屬于Vλ1、Vλ2或Vλ3亞家族的工程化的輕鏈可變結構域。9.如前述權利要求中任一項所述的異源二聚體抗體或其片段，包含IgGFc區。10.如權利要求9所述的異源二聚體抗體或其片段，其中所述IgGFc區包含在第336位具有取代的第一CH3區和在第336位、第368位和第407位具有取代的第二CH3區。11.如權利要求9所述的異源二聚體抗體或其片段，其中所述IgGFc區包含在第336位和第354位具有取代的第一CH3區和在第336位、第368位、第407位和第349位具有取代的第二CH3區。12.如權利要求11所述的異源二聚體抗體或其片段，其中所述第一CH3區包含取代T366W和S354C并且所述第二CH3區包含取代T366S、L368A、Y407A和Y349C。13.如前述權利要求中任一項所述的異源二聚體抗體或其片段，包含選自由以下各項組成的組的取代：i.所述VH和CH1中的Q39D和S165D，以及所述VL中的Q38K；ii.所述VH和CH1中的Q39K和K147D，以及所述κVL和CL中的Q38D和Q124K；iii.所述VH和CH1中的Q39D和S165D，以及所述κVL和CL中的Q38K和Q124D；iv.所述VH和CH1中的Q39K、K147D和S165R，以及所述κVL和CL中的Q38D、Q124K和K169D；v.所述VH和CH1中的Q39D和S165D，以及所述λVL和CL中的Q38K、E124D和N170K；以及vi.所述VH和CH1中的Q39D和S165D，以及所述λVL和CL中的Q38K和N170R。14.如前述權利要求中任一項所述的異源二聚體抗體或其片段，其中如通過液相色譜-質譜法所確定，實現最多至100％的異源二聚化。15.如前述權利要求中任一項所述的異源二聚體抗體或其片段，其中另外的Fab包含：在第39位、第147位包含帶電氨基酸并且在第165位包含帶電或中性氨基酸(EU編號)的工程化的重鏈可變結構域(VH)和恒定結構域1(CH1)；以及在第38位包含帶電氨基酸并且在第124位和第169/170位包含帶電或中性氨基酸(EU編號)的工程化的輕鏈可變結構域(VL)和恒定結構域(CL)，其中所述VH和CH1結構域以及所述VL和CL結構域中的所述氨基酸成對地具有相反電荷或為帶電的/中性的，并且相對應以形成在靜電方面有利于異源二聚化的界面；并且其中一個Fab的所述工程化的VH中的第39位、第147位和第165位中的每一個處的電荷與所述另外的Fab的所述工程化的VH中的第39位、第147位和第165位中的每一個處的電荷不同。16.如權利要求15所述的異源二聚體抗體或其片段，其中一個Fab包含所述VH和CH1中的取代Q39K、K147D和S165R以及所述VL和CL中的取代Q38D、Q124K和K169D；并且所述另外的Fab包含所述VH和CH1中的取代Q39D和S165D以及所述VL和CL中的選自以下各項的取代：(i)所述κVL和CL中的Q38K和Q124D；(ii)所述λVL中的Q38K；(iii)所述λVL和CL中的Q38K和N170R；或(iv)所述λVL和CL中的Q38K、E124D和N170K。17.如權利要求15或權利要求16所述的異源二聚體抗體或其片段，其中所述另外的Fab中的鏈間二硫鍵被工程化的VH-VL鏈間二硫鍵替換。18.如權利要求17所述的異源二聚體抗體或其片段，其中一個Fab包含所述VH和CH1中的取代Q39K、K147D和S165R以及所述VL和CL中的取代Q38D、Q124K和K169D；并且所述另外的Fab包含所述VH和CH1中的取代Q39D、G44C、S165D和C220A以及所述VL和CL中的選自以下各項的取代：(i)所述κVL和CL中的Q38K、Q100C、Q124D和C214A；(ii)所述λVL中的Q38K、G100C和C214A；(iii)所述λVL和CL中的Q38K、G100C、N170R和C214A；或(iv)所述λVL和CL中的Q38K、G100C、E124D、N170K和C214A。19.一種制備異源二聚體抗體或其片段的方法，所述異源二聚體抗體或其片段包含相對應以形成界面的工程化的VH和CH1結構域以及工程化的VL和CL結構域，所述方法包括置換所述VH和CH1結構域中的至少兩個氨基酸，使得所述工程化的結構域在第39位、第147位和第165位(EU編號)包含帶電...

【專利技術屬性】
技術研發人員：R·塞貝，S·伊里加拉，D·斯凱戈羅，
申請(專利權)人：諾華股份有限公司，
類型：發明
國別省市：瑞士,CH