一種用于檢測FMR1基因CGG重復數的質控品及其應用和含有該質控品的試劑盒制造技術

本發明專利技術提供一種用于檢測FMR1基因CGG重復數的質控品，其包括如SEQ ID NO:6所示序列的單鏈DNA以及如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示序列的引物，其中，所述單鏈DNA為SEQ ID NO:4、部分AluY序列與SEQ ID NO:5反向互補DNA序列組成的人工合成單鏈DNA。本發明專利技術還涉及采用上述質控品檢測X染色體倍型和判斷DNA模板量是否足量的方法以及含有該質控品的試劑盒。本發明專利技術在引入X染色體倍型監控系統的同時，采用非特異性探針雜交技術開發了一種針對TP?PCR擴增體系中X染色體拷貝數和起始DNA模板量是否適宜的質控系統，以確保TP?PCR檢測陰性結果的可靠性，實現了對FMR1基因CGG重復數的準確檢測。

A quality control material for detecting CGG repeat number of FMR1 gene and its application and kit containing the quality control material

【技術實現步驟摘要】
一種用于檢測FMR1基因CGG重復數的質控品及其應用和含有該質控品的試劑盒
本專利技術涉及分子生物學
，尤其涉及一種用于檢測FMR1基因CGG重復數的質控品及其應用和含有該質控品的試劑盒，所述應用為采用該質控品檢測X染色體倍型和判斷DNA模板量是否足量的方法。
技術介紹
脆性X綜合征(fragileXsyndrome，FraX，OMIM#300624)是最常見的X連鎖隱性遺傳疾病之一，發病率僅次于唐氏綜合征(Downsyndrome)，其致病基因是X染色體長臂脆性X智力低下1(FMR1)基因。典型的特征為中度到重度的智力障礙、巨睪丸、大耳朵、語言障礙、智商低下。據統計，在高加索人群中FraX的男性發病率約1：4000，女性發病率約1：5000-8000。國內尚無大規模的流行病學調查。99％以上的脆性X綜合征患者是由于FMR1的5'非翻譯區的CGG重復序列擴增導致FMRP表達沉默所致。CGG重復在人群中具有高度的多態性，在正常人中約在45拷貝以內。46-54為灰區，可擴增為前突變。當CGG重復數增多到55～200拷貝時，稱為前突變(premutation)。前突變者無或只有輕微的癥狀，但40％男性前突變攜帶者有患FXTAS的風險，21％女性前突變攜帶者有患FXPOI的風險。女性前突變攜帶者的CGG區不穩定，可擴增為全突變。當CGG重復數＞100時，其擴增成全突變(fullmutation)的概率高達98％以上。全突變CGG重復數達到200個拷貝以上，相鄰的CpG島異常甲基化，導致FMR1基因的沉默，從而出現臨床癥狀。脆性X綜合征目前尚無有效的治療方法，臨床主要采用對癥治療及康復理療等策略。降低脆性X綜合征發病率的有效策略通過產前篩查與診斷阻斷患兒的出生，產前篩查和診斷是本病預防的主要手段。目前實驗室常用的分子診斷技術有SouthernBlot、甲基化特異性PCR(MS-PCR)、長片段PCR擴增以及三核苷酸重復序列PCR(triplet-repeatprimed-PCR)等。相對于SouthernBlot、MS-PCR以及長片段擴增PCR等技術，TP-PCR技術在檢測靈敏度和準確性均具有顯著的優勢。三核苷酸重復序列的上游引物與擴增模板的CGG序列隨機互補，配合與目的擴增序列互補的下游引物，形成(CGG)4-5～(CGG)n的PCR。該擴增技術不受擴增模板CGG重復數的影響，可有效檢測＞1300的CGG重復序列：對于小于200CGG重復，可以算出精確重復數，理論上可區分1個CGG的差異；對于大于200CGG重復，為定性分析，標注為“＞200”。需要指出的是，依據TP-PCR擴增的原理，隨著擴增產物的片段大小的增加，其相應的擴增峰高逐漸衰減，在電泳譜圖中表現為擴增峰高(Rfu值)逐漸降低，且間隔為一個CGG重復(即3個bp)的一系列擴增峰信號。理想情況下，最后一個峰即為最長擴增片段的峰，檢測值與實際值一致。但是當DNA模板起始量不足、X染色體倍型不同、毛細管電泳進樣量不足時均有可能出現長片段擴增信號的消失或者低于系統的熒光信號檢測限，即檢測值低于實際值。特別是在45重復、55重復、200重復等區分正常、灰區、前突變、全突變的關鍵區域，如缺乏有效的質量控制，則可能出現假陰性的結果。如，當TP-PCR檢出CGG重復數為190時，會否是由于所加入的基因組DNA起始量不足或X染色體倍型不同)導致CGG擴增峰的過度衰減而至190后的CGG峰未檢出。常規PCR質控策略通過控制DNA模板上樣量、添加對照樣本的方式來進行質量控制。如Abbott公司的FMR1TP-PCRKit中對反應中DNA模板的使用表述為：“添加3uL的提取DNA樣本(10-25ng/μL)。”這種通過操作標準的控制來實現對檢測系統的質量控制，可以避免整體試驗的誤差，但無法有效避免因單個未知樣本差異而造成的檢測結果的判斷困難。影響未知樣本檢測結果判斷的最為重要的一個因素是X染色體的倍型。這也是《EMQN關于脆性X綜合征及相關疾病的分子遺傳學檢測和報告的最佳實踐指南》中要求在進行CGG重復數檢測時需要對X染色體倍型進行判斷的原因之一。一個PCR檢測試劑盒，檢測靈敏度是一個關鍵參數，并通常以所加入的模板DNA的最低起始量作為衡量標準，如模板DNA起始量不低于50ng。然而，由于FMR1基因是位于X染色體上，不同的X染色體倍型意味著相同的起始DNA質量卻是不同的X染色體拷貝數。100ng男性樣本(XY)中X染色體的拷貝數僅為同等質量女性DNA樣本中的一半。100ng超雌綜合征(XXX)中X染色體拷貝數為同等質量男性DNA樣本(XY)的三倍。而在當前關于采用TP-PCR技術進行CGG重復檢測的一些現有技術中，均未能提供在檢測CGG重復數的同時，對反應體系中X染色體拷貝數是否適量進行監控的技術方案，這使得在對依據這些技術方案的檢測結果進行評價時，陽性結果具有臨床意義(如已檢出CGG重復數超過200)，但陰性結果(如CGG重復數接近前突變界值或接近全突變界值)就難以下結論是不是假陰性結果。這也是該技術未能有效應用于產前診斷及產前篩查所需要考慮的關鍵問題之一。
技術實現思路
為了克服現有技術中存在的缺陷，本專利技術提供一種用于檢測FMR1基因CGG重復數的質控品，還涉及相關的質控方法和含有該質控品的試劑盒，本專利技術為了實現對FMR1基因TR-PCR檢測技術的結果控制，在引入X染色體倍型監控系統的同時，采用非特異性探針雜交技術開發了一種針對TP-PCR擴增體系中起始模板DNA量是否適宜的質控系統，以確保TP-PCR檢測陰性結果的可靠性，并利用上述的質量控制體系，采用TP-PCR的技術，實現對FMR1基因CGG重復數的檢測，精確區分正常樣本(5-45)、灰區(46-54)、前突變(55-200)及全突變(＞200)。為了實現上述目的，本專利技術采取的技術方案包括：本專利技術的第一個目的是提供一種用于檢測FMR1基因CGG重復數的質控品，其包括如SEQIDNO:6所示序列的單鏈DNA以及如SEQIDNO:4～SEQIDNO:5所示序列的引物；上述質控品用于在FMR1基因CGG重復數檢測時，監控PCR體系中所加入的起始DNA模板量是否足量的。SEQIDNO:6所示序列的人工合成的單鏈DNA是以人基因組DNA中的AluY序列中的部分高度保守序列為骨架，在5'端連接如SEQIDNO:4所示引物序列，3'端接連如SEQIDNO:5所示引物序列的反向互補序列，優選3'端最后一個堿基為雙脫氧胸腺嘧啶(Tdd)。其中SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示序列為依據人3號染色體與X染色體一同源片段所設計的PCR引物。由于這一特別設計，在PCR反應中，當未加入人基因組DNA時，SEQIDNO:5所示引物首先與SEQIDNO:6所示人工合成DNA單鏈的3'端互補結合并在DNA聚合酶的作用下形成雙鏈DNA，這一雙鏈DNA片段將成為SEQIDNO:4與SEQIDNO:5所示引物的PCR擴增模板，并在毛細管電泳時在100bp處出現特異性質控點擴增信本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種用于檢測FMR1基因CGG重復數的質控品，其特征在于，包括如SEQ ID NO:6所示序列的單鏈DNA以及如SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:5所示序列的引物；其中，所述單鏈DNA的5'端為SEQ ID NO:4所示序列，3'端為如SEQ ID NO:5所示序列的反向互補序列，中間部分來自于AluY序列；/n其中，所述引物用于擴增3號染色體片段、X染色體片段以及所述單鏈DNA，實現對FMR1基因CGG擴增系統中模板質量及X染色體倍型監控。/n

【技術特征摘要】
1.一種用于檢測FMR1基因CGG重復數的質控品，其特征在于，包括如SEQIDNO:6所示序列的單鏈DNA以及如SEQIDNO:4～SEQIDNO:5所示序列的引物；其中，所述單鏈DNA的5'端為SEQIDNO:4所示序列，3'端為如SEQIDNO:5所示序列的反向互補序列，中間部分來自于AluY序列；
其中，所述引物用于擴增3號染色體片段、X染色體片段以及所述單鏈DNA，實現對FMR1基因CGG擴增系統中模板質量及X染色體倍型監控。


2.根據權利要求1所述的一種用于檢測FMR1基因CGG重復數的質控品，其特征在于，所述單鏈DNA的3'端最后一個堿基為雙脫氧胸腺嘧啶。


3.一種采用如權利要求1或2所述的質控品判斷DNA模板量是否足量的方法，其特征在于，包括以下步驟：
步驟一、采用如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示序列的引物與DNA模板、如SEQIDNO:6所示序列的單鏈DNA進行反應，實現單鏈DNA、3號染色體片段、X染色體片段的擴增；
步驟二、步驟一獲得的擴增產物進行毛細管電泳并通過分析軟件得到電泳圖譜和數據，所述數據包括單鏈DNA的擴增產物峰高Hc、3號染色體的擴增產物峰高Hchr3、X染色體的擴增產物峰高HchrX；
步驟三、根據步驟二獲得的Hc及其與Hchr3的比值對DNA模板量進行判斷；
其中，當DNA模板加入量不足時，質控位點單鏈DNA在毛細管電泳100bp處出現顯著的擴增峰，且Hc與Hchr3比值大于0.5；
當DNA模板加入量足量時，單鏈DNA在毛細管電泳100bp處無擴增峰，或Hc與Hchr3比值低于0.5。


4.一種采用如權利要求1所述的質控品檢測X染色體倍型的方法，其特征在于，包括以下步驟：
步驟A、采用如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示序列的引物與DNA模板、進行反應，實現3號染色體片段、X染色體片段的擴增；
步驟B、步驟A獲得的擴增產物進行毛細管電泳并通過分析軟件得到電泳圖譜和數據，所述數據包括3號染色體的擴增產物峰高Hchr3、X染色體的擴增產物峰高HchrX；
步驟C、根據步驟B獲得的Hchr3與HchrX的比值對X染色體的倍型進行判定；
其中，當Hchr3/HchrX＞1.5時，提示只有1條X染色體；
當Hchr3/HchrX＝0.7～1.5時，提示有2條X染色體；
當Hchr3/HchrX＜0.7時，提示有3條或者3條以上的X染色體。


5.一種含有權利要求1或2所述的質控品的用于檢測FMR1基因CGG重復數的試劑盒。


6.根據權利要求5所述的用于檢測FM...

【專利技術屬性】
技術研發人員：靳超，孫寧霞，趙琪，王麗，
申請(專利權)人：上海晶準生物醫藥有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31