一種簡易可視化的轉(zhuǎn)基因植物篩選系統(tǒng)及其應(yīng)用技術(shù)方案

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種簡易可視化的轉(zhuǎn)基因植物篩選方法及其應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)所提供的一種簡易可視化的轉(zhuǎn)基因植物篩選方法為含有可視化標記基因的植物表達載體，所述含有可視化標記基因的植物表達載體為花青素生物合成途徑中的重要調(diào)控基因AtPAP2。本發(fā)明專利技術(shù)將顏色調(diào)控基因應(yīng)用到植物遺傳轉(zhuǎn)化操作上，有效減輕了轉(zhuǎn)化后的篩選工作，根據(jù)該基因在植株上的表現(xiàn)，可有選擇的保留有價值的轉(zhuǎn)化材料，從而大大節(jié)省篩選時間和研究經(jīng)費，且實驗結(jié)果的準確度和可信度大大提高，這為開展轉(zhuǎn)化后分析工作奠定了很好的基礎(chǔ)。另外，本發(fā)明專利技術(shù)利用顏色基因的瞬時表達，可更為直觀地對轉(zhuǎn)化效果進行可視化分析，從而避免各種影響轉(zhuǎn)化因素的發(fā)生。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種簡易可視化的轉(zhuǎn)基因植物篩選系統(tǒng)及其應(yīng)用
本專利技術(shù)涉及轉(zhuǎn)基因植物領(lǐng)域，具體為一種簡易可視化的轉(zhuǎn)基因植物篩選系統(tǒng)及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
花青素是一類在植物中廣泛存在的次級代謝產(chǎn)物，屬于黃酮類物質(zhì)。在自然界中花青素賦予了花草、樹木多彩繽紛的顏色，有助于其吸引各種昆蟲媒介進行授粉、種子傳播，同時，花青素在植物抵抗各種逆境脅迫等方面也具有較為重要的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，花青素在治療心臟病和癌癥，清除自由基、抗氧化、抗衰老等方面具有重要療效[4]，因而關(guān)于花青素的研究也越來越受到人們的重視。因此用花青素代替?zhèn)鹘y(tǒng)的篩選標記是安全的。目前傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炛饕猲ptII為篩選標記，gus或gfp為報告基因，篩選效率低、準確性差。報告基因用于檢測轉(zhuǎn)化事件。理想的報告基因應(yīng)具有易檢測、低內(nèi)源背景、易定量分析等特點，檢測過程不應(yīng)對植株造成損傷。常用的報告基因有beta-葡萄糖苷酸酶，螢火蟲熒光素酶，綠色熒光蛋白等。雖然目前有很多種方法檢測是否為轉(zhuǎn)基因植株，但是以花青素基因作為遺傳轉(zhuǎn)化的報告基因優(yōu)勢明顯：無需篩選條件、無需進行組織化學(xué)檢測或特殊的儀器設(shè)備、肉眼即可觀測，十分方便。
技術(shù)實現(xiàn)思路
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中轉(zhuǎn)基因篩選的篩選效率低、準確性差的問題，本專利技術(shù)從擬南芥中分離克隆了AtPAP2基因并構(gòu)建了高效的植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將AtPAP2基因轉(zhuǎn)入到煙草中，培養(yǎng)獲得了紫色的煙草，并利用qRT-PCR檢測了轉(zhuǎn)AtPAP2基因煙草中花青素合成相關(guān)基因的表達量變化情況，初步解析了AtPAP2基因在花青素合成中的作用，本專利技術(shù)具體是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種簡易可視化的轉(zhuǎn)基因植物篩選方法，具體包括以下步驟：步驟a.得到AtPAP2基因；步驟b.將AtPAP2基因轉(zhuǎn)接入pMD18-T載體中，得到pMD18-PAP2；步驟c.將步驟b得到pMD18-PAP2轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，得到含有pMD18-PAP2的大腸桿菌DH5α；步驟d.提取pMD18-PAP2和植物表達載體pGNP的質(zhì)粒DNA，分別進行限制性酶切反應(yīng)并回收目的片段后進行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，得到重組質(zhì)粒DNA，命名為pGNP-PAP2；步驟e.將步驟d得到的pGNP-PAP2轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞；步驟f.將步驟e得到的含有pGNP-PAP2的農(nóng)桿菌EHA105浸染并將其導(dǎo)入受體植物細胞中。進一步的，所述AtPAP2基因是以擬南芥cDNA為模板，利用引物對pPAP2-F和pPAP2R進行PCR擴增獲取的，所述pPAP2-F核苷酸序列為：5’-ATGGAGGGTTCGTCCAAAG-3’，所述pPAP2-R核苷酸序列為：5’-CAAGTTCAACAGTCTCTCC-3’。進一步的，所述pMD18-T載體是通過引物對M13-F和M13-R進行PCR擴增獲取的，所述M13-F核苷酸序列為：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’，所述M13-R核苷酸序列為：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。進一步的，提取pMD18-PAP2和植物表達載體pGNP的質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶BstXI和KpnI分別進行雙酶酶切反應(yīng)，純化相應(yīng)的質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，利用膠回收純化試劑盒分別純化相應(yīng)的質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，并在T4DNA連接酶作用下進行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，得到重組質(zhì)粒DNA，命名為pGNP-PAP2。同時，提出了基于權(quán)利要求1至4任一所述的方法在篩選轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。進一步的，所述轉(zhuǎn)基因植物為煙草。本專利技術(shù)的有益效果是：AtPAP2在煙草中可以高效表達，農(nóng)桿菌浸染過后約2個周即可看到紫色愈傷出現(xiàn)，紫色愈傷長成的紫色煙草相對于正常的野生型煙草，僅存在顏色差異，生長狀態(tài)，生長速度均不受影響，表明AtPAP2基因可以在煙草中表達且不影響煙草的正常生長。AtPAP2作為報告基因最大的優(yōu)勢是轉(zhuǎn)化后較短的時間內(nèi)就可以直接的觀察到紫色愈傷和紫色的煙草，不需要組織化學(xué)染色和特殊的儀器觀察，極其方便。因此AtPAP2具有傳統(tǒng)報告基因不可比擬的優(yōu)勢，十分適合在煙草的遺傳轉(zhuǎn)化中作為報告基因使用。附圖說明圖1為本專利技術(shù)中花青素生物合成途徑的流程圖；圖2為擬南芥葉片總RNA提取和AtPAP2基因克隆結(jié)果，其中，A為擬南芥葉片總RNA，B為擬南芥AtPAP2基因的克??；圖3為物表達載體pGNP-PAP2的構(gòu)建圖譜；圖4為載體pMD18-AtPAP2雙酶切產(chǎn)物；圖5為農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化子的單克隆菌液PCR產(chǎn)物；圖6為轉(zhuǎn)基因煙草株系的PCR檢測；圖7為轉(zhuǎn)AtPAP2基因煙草植株表型觀察，其中，A：農(nóng)桿菌浸染后的煙草葉片；B：紫色抗性愈傷組織；C：愈傷組織分化出叢生芽；D-E：誘導(dǎo)生根的紫色抗性煙草小苗；F-H：轉(zhuǎn)基因煙草(右)和未轉(zhuǎn)基因煙草(左)整株、根部和葉片的比較。具體實施方式下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本專利技術(shù)技術(shù)方案做進一步詳細描述：一種簡易可視化的轉(zhuǎn)基因植物篩選方法，具體包括以下步驟：步驟a.得到AtPAP2基因；步驟b.將AtPAP2基因轉(zhuǎn)接入pMD18-T載體中，得到pMD18-PAP2；步驟c.將步驟b得到pMD18-PAP2轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，得到含有pMD18-PAP2的大腸桿菌DH5α；步驟d.提取pMD18-PAP2和植物表達載體pGNP的質(zhì)粒DNA，分別進行限制性酶切反應(yīng)并回收目的片段后進行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，得到重組質(zhì)粒DNA，命名為pGNP-PAP2；步驟e.將步驟d得到的pGNP-PAP2轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞；步驟f.將步驟e得到的含有pGNP-PAP2的農(nóng)桿菌EHA105浸染并將其導(dǎo)入受體植物細胞中。進一步的，所述AtPAP2基因是以擬南芥cDNA為模板，利用引物對pPAP2-F和pPAP2R進行PCR擴增獲取的，所述pPAP2-F核苷酸序列為：5’-ATGGAGGGTTCGTCCAAAG-3’，所述pPAP2-R核苷酸序列為：5’-CAAGTTCAACAGTCTCTCC-3’。進一步的，所述pMD18-T載體是通過引物對M13-F和M13-R進行PCR擴增獲取的，所述M13-F核苷酸序列為：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’，所述M13-R核苷酸序列為：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。進一步的，提取pMD18-PAP2和植物表達載體pGNP的質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶BstXI和KpnI分別進行雙酶酶切反應(yīng)，純化相應(yīng)的質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，利用膠回收純化試劑盒分別純化相應(yīng)的質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，并在T4DNA連接酶作用下進行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，得到重組質(zhì)粒DNA，命名為pGNP-PAP2。同時，提出了基于權(quán)利要求1至4本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
1.一種簡易可視化的轉(zhuǎn)基因植物篩選方法，其特征在于，具體包括以下步驟：/n步驟a.得到AtPAP2基因；/n步驟b.將AtPAP2基因轉(zhuǎn)接入pMD18-T載體中，得到pMD18-PAP2；/n步驟c.將步驟b得到pMD18-PAP2轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，得到含有pMD18-PAP2的大腸桿菌DH5α；/n步驟d.提取pMD18-PAP2和植物表達載體pGNP的質(zhì)粒DNA，分別進行限制性酶切反應(yīng)并回收目的片段后進行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，得到重組質(zhì)粒DNA，命名為pGNP-PAP2；/n步驟e.將步驟d得到的pGNP-PAP2轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞；/n步驟f.將步驟e得到的含有pGNP-PAP2的農(nóng)桿菌EHA105浸染并將其導(dǎo)入受體植物細胞中。/n

【技術(shù)特征摘要】
1.一種簡易可視化的轉(zhuǎn)基因植物篩選方法，其特征在于，具體包括以下步驟：
步驟a.得到AtPAP2基因；
步驟b.將AtPAP2基因轉(zhuǎn)接入pMD18-T載體中，得到pMD18-PAP2；
步驟c.將步驟b得到pMD18-PAP2轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，得到含有pMD18-PAP2的大腸桿菌DH5α；
步驟d.提取pMD18-PAP2和植物表達載體pGNP的質(zhì)粒DNA，分別進行限制性酶切反應(yīng)并回收目的片段后進行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，得到重組質(zhì)粒DNA，命名為pGNP-PAP2；
步驟e.將步驟d得到的pGNP-PAP2轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞；
步驟f.將步驟e得到的含有pGNP-PAP2的農(nóng)桿菌EHA105浸染并將其導(dǎo)入受體植物細胞中。


2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述AtPAP2基因是以擬南芥cDNA為模板，利用引物對pPAP2-F和pPAP2R進行PCR擴增獲取的，所述pPAP2-F核苷酸序列為：
5’-ATGGAGGGTTCGTC...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：姚偉，黃振，段真珍，周宇明，李慧雪，張木清，
申請(專利權(quán))人：廣西大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：廣西;45