一種利用熒光標記痘病毒顆粒的方法及其應用技術

本發明專利技術提供一種利用熒光標記痘病毒顆粒的方法及其應用，該方法利用CFSE熒光染料染色痘病毒顆粒，得到CFSE標記的痘病毒顆粒，另外本發明專利技術提供熒光標記痘病毒顆粒的應用，用于獲取痘病毒顆粒感染靶細胞的情況，此時，CFSE標記的痘病毒顆粒可以在體外或體內感染靶細胞，通過流式細胞儀檢測CFSE熒光顆粒的數量或者熒光顯微鏡下觀察CFSE熒光顆粒的數量和分布情況，即可快速檢測痘病毒顆粒感染靶細胞的情況，整個步驟不需要購置特殊的病毒或種屬特異性抗體，具有檢測快速高效，成本低的特點和優勢。

【技術實現步驟摘要】
一種利用熒光標記痘病毒顆粒的方法及其應用
本專利技術涉及病毒檢測領域，特別涉及一種利用熒光標記測痘病毒顆粒的方法及其應用。
技術介紹
痘病毒，是能夠使得人和動物被感染后引起局部或者全身化膿性皮膚損害的病毒。痘病毒，屬于痘病毒科，其種類繁多，包括天花病毒、猴痘病毒、牛痘病毒、鼠痘病毒、雞痘病毒等，不僅如此，痘病毒也是病毒顆粒最大的一類DNA病毒，其有著復雜龐大、高達200Kb的雙鏈DNA基因組，病毒顆粒直徑超過0.2μm。實時、可視化的病毒侵染宿主細胞的過程有助于從本質上詮釋病毒的侵染機制及致病機理,為了成功地跟蹤病毒，需要一種有效的標記方法。病毒標記技術可分為熒光蛋白標記和化學標記：熒光蛋白標記主要是指重組熒光蛋白標記；化學標記技術主要包括量子點技術，雙砷結合技術，點擊化學以及化學熒光染料標記技術。盡管基因工程和化學偶聯已被應用于追蹤宿主細胞和體內的病毒感染，但這些策略可能會干擾病毒的侵入途徑，而且技術要求高、過程繁瑣、效率不高。熒光染料(CFSE)，是一種可對活細胞進行熒光標記的小分子新型染料，可以標記活體細胞。其基本原理如下：CFSE能夠輕易穿透細胞膜，在活細胞內與胞內蛋白共價結合，水解后釋放出綠色熒光。CFSE主要用于細胞增殖，體內細胞追蹤，細胞毒性檢測等，此方法操作簡單，且不用放射性同位素，不存在安全隱患，且可以更快速，更準確和更安全的得到想要的實驗數據。然而CFSE通常應用于真核細胞標記，也偶見于原核細胞如細菌，在病毒中未見有報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種利用熒光標記痘病毒顆粒的方法及其應用，該方法利用CFSE熒光染料染色痘病毒顆粒，得到CFSE標記的痘病毒顆粒，另外本專利技術提供熒光標記痘病毒顆粒的應用，用于檢測痘病毒顆粒感染靶細胞的情況，此時，CFSE標記的痘病毒顆粒可以在體外或體內感染靶細胞，通過流式細胞儀檢測CFSE熒光顆粒的數量或者熒光顯微鏡下觀察CFSE熒光顆粒的數量和分布情況，即可快速檢測痘病毒顆粒感染靶細胞的情況，整個步驟不需要購置特殊的病毒或種屬特異性抗體，具有檢測快速高效，成本低的特點和優勢。為實現以上目的，本方案提供一種利用熒光標記痘病毒顆粒的方法,包括以下步驟:取純化的痘病毒顆粒，加入CFSE熒光染料進行染色，得到CFSE標記的痘病毒顆粒。在本方案中，將加入CFSE熒光染料的痘病毒顆粒置于37攝氏度室溫條件下孵育15-45分鐘，在孵育結束后，加入2倍體積的含有10％FBS的完全培養基終止染色。另外，可通過流式細胞儀檢測CFSE熒光顆粒的數量或在熒光顯微鏡下觀察CFSE熒光顆粒。其中熒光顯微鏡選擇為倒置熒光顯微鏡，本申請人通過多次驗證實驗證明CFSE熒光染料的確可以染色痘病毒顆粒。另，本方案提供一種利用熒光標記痘病毒顆粒的應用，用于獲取痘病毒顆粒感染靶細胞的情況。此時，該方案的具體步驟如下：步驟S1:取純化的痘病毒顆粒，加入熒光染色試劑CFSE熒光染料進行染色，得到CFSE標記的痘病毒顆粒；步驟S2：將CFSE標記的痘病毒顆粒按照設定濃度比例加入待檢測樣本中，其中待檢測樣本內含有靶細胞；步驟S3:用熒光顯微鏡觀察CFSE熒光顆粒，根據CFSE熒光顆粒的位置分布來判斷痘病毒顆粒是否感染靶細胞，若CFSE熒光顆粒出現在靶細胞表面或細胞內則表示痘病毒顆粒成功感染靶細胞。另外，在步驟S3中用流式分析儀對CFSE標記的痘病毒顆粒或是CFSE標記痘病毒感染后的靶細胞進行熒光檢測，觀察CFSE熒光顆粒的數量可以分析痘病毒顆粒的濃度和殘留情況。在本方案的一實施例中，在步驟S3當中用倒置熒光顯微鏡在200倍的物鏡下進行觀察。值得一提的是，該方法特別適用于在科研過程中研究痘病毒顆粒感染細胞的情況，可用該方法直接觀察培養皿中及在體的痘病毒顆粒，用于研究各種環境條件變化對痘病毒顆粒感染細胞的影響，也可以對痘病毒顆粒分布的變化情況進行定性和定量分析。在本方案的步驟S1中，首先需要對痘病毒顆粒進行CFSE熒光標記。標記步驟中，CFSE和痘病毒顆粒的濃度和比例控制為1-10μM:0.5-5×108pfu/ml。以上濃度比例可以保證全部痘病毒顆粒被標記，并發出較強的可檢測的熒光信號。在本方案的步驟S2中，需要用CFSE標記的痘病毒顆粒體外感染或在體感染靶細胞，對應的，待檢測樣本可以是平面或懸浮培養的靶細胞樣本，也可以是含有靶細胞的組織樣本。若待檢測樣本是平面或懸浮培養的靶細胞樣本，可以直接在培養基中加入CFSE標記的痘病毒顆粒進行感染，CFSE標記的痘病毒顆粒和靶細胞的比例控制在0.5以上，并且可以直接在倒置熒光顯微鏡下觀察病毒顆粒分布及靶細胞感染情況。若待檢測樣本是含有靶細胞的組織樣本，應往活體內注射一定劑量的CFSE標記的痘病毒顆粒，取活體的組織樣本制備組織切片，組織切片用熒光染料進行細胞核染色后可以在倒置熒光顯微鏡下進行病毒顆粒觀察。以小鼠為例，可以通過活體腹腔注射的方式注入CFSE標記的痘病毒，病毒劑量可以是每只小鼠1-10x106pfu。在本方案中，染色條件為在37攝氏度室溫條件下孵育15-45分鐘，隨即用2倍體積含有10％FBS的完全培養基中止染色。本方案中的痘病毒的種類不受限制，所述痘病毒顆粒是痘病毒科的常見種類痘病毒，包括牛痘病毒，雞痘病毒，天花病毒，豬痘病毒的任一種。另，得到CFSE標記的痘病毒顆粒僅需要15-45分鐘即可，其后利用得到CFSE標記的痘病毒顆粒感染靶細胞，利用熒光顯微鏡觀察CFSE熒光顆粒的分布情況獲知靶細胞的被感染情況，相較其他痘病毒的檢測方法來說效率和時間都有了很大的提升。本方案不僅僅可以在痘病毒顆粒感染細胞過程中定性檢測痘病毒顆粒，還可定量檢測痘病毒顆粒。定性分析：在步驟S1中用過量的CFSE熒光染料染色標記痘病毒顆粒，隨后用CFSE標記的痘病毒顆粒感染靶細胞，再利用熒光顯微鏡觀察CFSE熒光顆粒的分布情況即可獲知痘病毒顆粒感染靶細胞的感染情況。定量分析：用流式分析儀對CFSE標記的痘病毒顆粒進行熒光檢測，觀察CFSE熒光顆粒的數量來分析痘病毒顆粒的濃度；用流式分析儀對CFSE標記痘病毒感染后的靶細胞進行熒光檢測，觀察CFSE熒光顆粒的數量來分析痘病毒顆粒感染靶細胞的數量。由于痘病毒顆粒很大，直徑可達到0.2-0.3um，接近細菌大小，且痘病毒顆粒的蛋白質衣殼外還包括一層有磷脂和蛋白組成的包膜，痘病毒顆粒的大尺寸和特殊的包膜結構使得痘病毒顆粒具有被CFSE染色的條件。基于其上的原理，本申請人在研究過程中發現痘病毒顆粒可以被CFSE染色，在此基礎上本申請人研發利用熒光染色方法檢測痘病毒顆粒感染細胞情況的方法，利用CFSE染色標記的痘病毒顆粒感染靶細胞，通過流式細胞儀檢測CFSE熒光顆粒的數量或熒光顯微鏡觀察CFSE熒光顆粒的分布和數量來分析痘病毒顆粒感染靶細胞的情況，該方法不需要購買特殊的病毒抗體，在科研過程中可以直接利用該方法觀察培養皿中及在體組織中的痘病毒顆粒感染細胞的情況，也可以對本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種利用熒光標記痘病毒顆粒的方法,其特征在于,包括以下步驟:/n取純化的痘病毒顆粒，加入CFSE熒光染料進行染色，得到CFSE標記的痘病毒顆粒。/n

【技術特征摘要】
1.一種利用熒光標記痘病毒顆粒的方法,其特征在于,包括以下步驟:
取純化的痘病毒顆粒，加入CFSE熒光染料進行染色，得到CFSE標記的痘病毒顆粒。


2.根據權利要求1所述的利用熒光標記痘病毒顆粒的方法,其特征在于,加入CFSE熒光染料的痘病毒顆粒置于37攝氏度室溫條件下孵育15-45分鐘，在孵育結束后，加入2倍體積的含有10％FBS的完全培養基終止染色。


3.根據權利要求1所述的利用熒光標記痘病毒顆粒的方法,其特征在于,通過流式細胞儀檢測CFSE熒光顆粒的數量或在熒光顯微鏡下觀察CFSE熒光顆粒。


4.一種利用熒光標記痘病毒顆粒的方法的應用，其特征在于，用于獲取痘病毒顆粒感染靶細胞的情況。


5.根據權利要求4所述的利用熒光標記痘病毒顆粒的應用，其特征在于，包括以下步驟：
步驟S1:取純化的痘病毒顆粒，加入CFSE熒光染料進行染色，得到CFSE標記的痘病毒顆粒；
步驟S2：將CFSE標記的痘病毒顆粒按照設定的濃度比例加入待檢測樣本中，其中待檢測樣本內包括靶細胞；
步驟S3:用熒光顯微鏡觀察CFSE熒光顆粒，根據CFSE熒光顆粒的位置分布來判斷痘病毒顆粒是否感染靶細胞，若CFSE熒光顆粒出現在靶細胞表面或靶細胞內則表示痘病...

【專利技術屬性】
技術研發人員：朱建高，楊文君，
申請(專利權)人：浙江康佰裕生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：浙江;33