產氣莢膜梭菌表面聚糖及其應用制造技術

免疫原性聚糖化合物，其具有用6?連接的磷酸乙醇胺和6?連接的磷酸甘油可變修飾的聚?β?1,4?ManNAc重復單元結構。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】產氣莢膜梭菌表面聚糖及其應用
本申請涉及產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)表面聚糖及其在由產氣莢膜梭菌引起的感染的疫苗及診斷和治療中的用途。
技術介紹
產氣莢膜梭菌是一種產生毒素的革蘭氏陽性厭氧細菌，其為人類食源性疾病的最常見原因之一(Grassetal.(2013))，并且還在許多牲畜物種中導致腸道疾病(Songer(1996)；Uzaletal.(2010))。產氣莢膜梭菌是禽類壞死性腸炎(NE)的主要原因(Al-Sheikhlyetal.(1977a)；Timbermontetal.(2010))，其對家禽業構成了重大問題。該疾病導致急性感染發作后24小時內迅速死亡，在大多數情況下排斥治療(Calyetal.(2015)，并且亞臨床感染與腸粘膜的慢性損傷有關，從而導致體重增加減少和飼料效率降低(Elwingeretal.(1998)；Hofacreetal.(2003)；Hofshagenetal.(1992)；Kaldhusdaletal.(2001))。據估計NE在全球范圍內總共導致家禽業每年20億美元的損失(VanderSluis(2000))。此外，歐洲禁止對牲畜預防性使用抗生素(歐盟，第1831/2003號法規(EC))已導致歐洲國家NE暴發增加(VanImmerseel.etal.(2004))，其已經導致了重度感染產氣莢膜梭菌的動物群與健康的動物群相比利潤損失了33％(Lovlandetal.(2001))。這些損失凸顯了代替抗生素治療的替代預防策略的必要性。盡管在牲畜環境中產氣莢膜梭菌很重要，并且莢膜多糖(CPS)被鑒定為Hobbs分型方案的主要抗原決定簇(Hughesetal.(1976))，但關于鑒定并表征該生物體表面上存在的碳水化合物結構的研究開展甚少。僅對來自產氣莢膜梭菌Hobbs5、9和10的CPS結構進行了詳細檢查，從而在1977年確定了Hobbs9CPS的組合物為1:1.6:1.1比例的葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)和半乳糖胺(GalN)(Cherniaketal.(1977))，并且分別在1997年和1998年通過NMR波譜法解析了Hobbs5和Hobbs10CPS的完整結構(Kalelkaretal.(1997)；和Shengetal.(1997))。除CPS結構外，許多革蘭氏陽性細菌還會產生細胞壁磷壁酸(WTA)和脂磷壁酸(LTA)，但很少進行產氣莢膜梭菌中這些或其他碳水化合物結構的存在和潛在的重要性的檢查。Richteretal(2013)指出產氣莢膜梭菌SM101基因組中存在LTA合酶基因(ltaS)的三種同源物，并證明產氣莢膜梭菌SM101對LTA合成的小分子抑制劑非常敏感，表明了LTA在產氣莢膜梭菌中的存在和重要性，然而尚未證明存在LTA也未在該細菌中對其進行結構表征，直到最近，Vinogradovetal.(2017)報告產氣莢膜梭菌ATCC13124產生具有β-ManNAc6PEtN-(1→4)-[β-ManNAc6PEtN-(1→4)]-β-ManNAc-(1→4)-β-ManNAc6PEtN[3-Ribf]-(1→4)-β-ManN-(1→4)-β-Glc-(1→1)-Gro的重復結構的LTA。沒有已知的針對產氣莢膜梭菌的基于多糖的疫苗。迄今為止的疫苗接種策略都集中在蛋白質抗原的使用上，如由產氣莢膜梭菌產生的毒素的解毒形式(類毒素)和產氣莢膜梭菌表面和分泌的蛋白質，其產生不同程度的保護(Motetal.(2014))。由于產氣莢膜梭菌菌株產生的多于一種毒素會引起牲畜疾病，包括雞中的NE，因此有效的蛋白質疫苗策略可能需要包含多于一種類毒素的多價疫苗。可商購的用于家禽的產氣莢膜梭菌疫苗((MerckAnimalHealth,WhitehouseStation,NJ)和梭菌類毒素自身疫苗(Vacci-VetTM,Saint-Hyacinthe,QC,加拿大)基于α-毒素類毒素，但此后證明NetB毒素在雞的產氣莢膜梭菌病理學中起著更為關鍵的作用。此外，最近的NE疫苗研究發現，只有組合使用α毒素和NetB來源的抗原時，才能觀察到明顯的保護水平(Jiangetal.(2015))。開發NE疫苗的主要考慮因素之一是，由于雞的市場價值低，其生產起來必須便宜，并且對于用于家禽而言，需要多種抗原而不是單一抗原的疫苗策略可能會被證明成本過高。仍然需要從產氣莢膜梭菌中鑒定出一種保守的免疫原性靶分子，其引起廣泛的交叉反應性免疫反應，以用作針對雞NE、其他牲畜疾病和由產氣莢膜梭菌引起的人類食物中毒的安全且有效的疫苗中的主要抗原。提供這些背景信息的目的是使申請人所相信的已知信息與本專利技術可能相關。并非必然旨在承認也不應解釋為，任何上述信息構成了針對本專利技術的現有技術。
技術實現思路
本專利技術基于識別保守的產氣莢膜梭菌抗原，其包含具有用6-連接的磷酸乙醇胺和6-連接的磷酸甘油可變修飾的聚-β-1,4-ManNAc重復單元結構的多糖。概括地，本專利技術包括免疫原性聚糖化合物，其包含用至少一個6-連接的磷酸甘油修飾的聚-β-1,4-ManNAc重復單元結構。在一個方面，本專利技術可以包括免疫原性產氣莢膜梭菌特異性表面聚糖，其包含分離的、合成的和/或純化的形式的式I的化合物、其脂質連接的或游離的或類似物或修飾形式：其中n≥1，Glc代表葡萄糖，ManNAc代表N-乙酰甘露糖胺(2-乙酰胺基-2,6-二脫氧-甘露糖)、ManN代表甘露糖胺(2-氨基-2-脫氧-D-吡喃甘露糖)、Gro代表甘油，并且其中R1、R2、R3和R4中的每個包含任意取代基或修飾，只要R1-R4中的至少一個是磷酸甘油(–PGro)；R5包含任意修飾，如–OH；并且R6包含-H或–Ac。在一種實施方式中，重復結構的末端拷貝中的一個R5可以包含糖，如Ribf(呋喃核糖)。在一些實施方式中，式I的聚糖包含化合物，其中R1-R4中的至少一個是PGro，并且R1-R4中的至少一個、兩個或三個是磷酸乙醇胺或OH。在一些實施方式中，聚糖具有分離的、合成的和/或純化的形式的式II的結構、其脂質連接的或游離的或類似物或修飾形式：在一些實施方式中，式I或II的化合物或者其免疫原性類似物或修飾形式可以例如與脂質連接或與單個氨基酸、寡肽、肽或蛋白質綴合。在另一方面，本專利技術可以包括產生抗體或抗血清的方法，包括以下步驟：提供帶有包含全部或部分式I或II的聚糖的抗原性表面結構的化合物，用該化合物接種動物以刺激對該化合物的免疫反應，從所述動物中抽取血清，并任選地純化所述血清以獲得特異性地與聚糖結合的抗體或抗血清。抗體或抗血清可用于診斷目的以檢測動物或人體內產氣莢膜梭菌的存在，或者可用于被動免疫方法以治療實際或潛在的產氣莢膜梭菌感染。本專利技術的化合物可以用于針對產氣莢膜梭菌的有或沒有佐劑的疫苗制劑，該疫苗制劑可以給藥至家禽，如雞或其他牲畜。該化合物還可以用于哺乳動物如人的疫苗制劑中，因為產氣莢膜梭菌也是食用受污染的食物(諸如牛肉或禽肉)而導致本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種免疫原性聚糖化合物，所述免疫原性聚糖化合物具有用至少一個6-連接的磷酸甘油修飾的聚β-1,4-ManNAc重復單元結構。/n

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】20171219 US 62/607,8481.一種免疫原性聚糖化合物，所述免疫原性聚糖化合物具有用至少一個6-連接的磷酸甘油修飾的聚β-1,4-ManNAc重復單元結構。


2.根據權利要求1所述的聚糖，所述聚糖包含分離的、合成的和/或純化形式的式I的化合物，任選地其綴合的或免疫原性類似物或修飾形式：



其中n≥1；R1、R2、R3和R4中的每個都包含任意修飾，只要其中的至少一個是磷酸甘油(–PGro)；R5包含任意修飾；并且R6包含-H或–Ac。


3.根據權利要求2所述的聚糖，其中R5是–OH和/或所述重復結構的末端拷貝中的R5包含糖，如呋喃核糖。


4.根據權利要求2或3所述的聚糖，其中R1-R4中的至少一個是PGro，并且R1-R4中的至少一個、兩個或三個是磷酸乙醇胺。


5.根據權利要求2-4中任一項所述的聚糖，其中約25％的R1-R4是–PGro。


6.根據權利要求2所述的聚糖，所述聚糖包含式II的化合物或其免疫原性類似物或修飾形式，其中n≥1：





7.根據權利要求1-6中任一項所述的聚糖，所述聚糖與脂質、單個氨基酸、寡肽、肽或蛋白質連接。


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【專利技術屬性】
技術研發人員：克里斯蒂娜·希曼斯基，科里·溫策爾，馬里奧·費爾德曼，多米尼克·米爾斯，
申請(專利權)人：阿爾伯塔大學理事會，
類型：發明
國別省市：加拿大;CA