超聲聯合微泡建立大鼠腦出血模型的方法技術

本發明專利技術涉及超聲聯合微泡建立大鼠腦出血模型的方法，屬于生物模型制備技術領域。該方法執行如下，1）SPF級雄性SD大鼠一只，體質量240?270g；2）準備工作；3）在輔助工具幫助下,從大鼠尾靜脈注入微泡造影劑，注入量依照所述大鼠的體質量決定；4）超聲干預；5）對大鼠行頭CT平掃；6）以白熾燈照射大鼠至少2h，保持肛溫在37±0.5℃；7）對大鼠神經功能評分，并飼養觀察待用。本發明專利技術通過超聲靶向作用于造影劑，借助微泡瞬間空化效應，對腦內目標區局部血管產生破壞作用，使得大鼠出現腦實質內出血現象，符合自發性腦出血的研究要求，具有無創、簡便、易推廣的優點，是合適的可再現的生物造模方法。同時，還引入了輔助設備，使得操作更為簡便可行。

【技術實現步驟摘要】
超聲聯合微泡建立大鼠腦出血模型的方法
本專利技術涉及超聲聯合微泡建立大鼠腦出血模型的方法，屬于生物模型制備

技術介紹
腦出血（IntracerebralHemorrhage，ICH）是神經科常見的腦血管疾病，具有致病率、致殘率、復發率、致死率高的特點，并且發病率逐年上升，發病年齡趨于年輕化。腦出血的臨床治療,大多以脫水降顱壓、手術減壓和康復鍛煉為主,但多數病人仍遺留不同程度神經功能障礙,對家庭及社會造成嚴重的醫療經濟負擔，影響患者及家庭生活質量。因此，建立可重復性高、穩定性好，與人類高度相似的腦出血動物模型，才能對腦出血的發病機制、病理生理改變、治療等方面進行有效深入的研究。目前已知的腦出血造模方法有以下幾種，分別為膠原酶誘導腦出血模型、自體血注入形成腦出血模型、自發性腦出血動物模型、微球囊充脹腦出血模型。膠原酶誘導腦出血模型是一種彌漫性的滲血，血腫形成時間較長，不具有急性的占位效應，并且膠原酶具有細胞毒性作用，血腫周圍炎性反應很重，可以直接破壞血腦屏障并損傷腦組織，這與單純自發性腦出血對腦組織的損害存在一定差異，因此并不能完全模擬人類自發性腦出血后二次腦損傷的病理生理過程，不適合用來進行血腫周圍腦組織血液循環障礙的研究，具有局限性。自體血注入形成腦出血模型形成的腦內血腫并非腦內血管破裂引起，血腫量與血腫形態沒有直接關系，注射過快易有血液反流溢出，過慢會出現血液凝固在針內的情況，血腫在腦內的壓力也很難固定，容易出現血腫脹裂腦組織流入腦室形成腦室內血腫的情況，所以形成的血腫在形態和大小的重復性上差。自發性腦出血動物模型不足之處是這容易出現斷種、變種的情況，遺傳方面存在局限性，并且飼養困難、制作成本較高、取得來源較少。微球囊充脹腦出血模型只能模擬腦出血后腦內血腫的占位效應，忽略了其他原因在腦出血后對腦組織造成的影響。另外，為避免單一方法制作的缺點，目前也有使用復合型的方法，如膠原酶誘導＋自體血注入誘導腦出血模型、膠原酶＋肝素注入誘導腦出血模型、自體血＋肝素注入制作腦出血模型，改變遺傳基因的方式＋自體血注入法結合。雖然都從一定程度上解決了原先方法中的問題，但其符合前自身所存在的缺陷均沒有完全被解決，只能說是“1+1=2”的方案，完全沒超越前人方案。當然還有介入穿刺式的造模方案，但實際操作中需要根據實驗者對造模過程的熟練程度來保證造模的成功率，缺乏大規模應用基礎，再現難度大。自發性腦出血的發生是腦內血管破裂出血,上述方法均不能模擬該病理過程，同時存在建模過程技術要求高、有創、無法標準化等問題。所以亟需一種方法，能夠從根本上解決目前對于腦出血造模這一方案中所遇到的問題。
技術實現思路
為了解決以上技術問題，本技術方案的目的在于解決現有技術的不足，提供一種超聲聯合微泡建立大鼠腦出血模型的方法。本技術方案的超聲聯合微泡建立大鼠腦出血模型的方法，執行如下步驟：1）SPF級雄性SD大鼠一只，體質量240-270g；2）準備工作；將大鼠固定于腦立體定位儀上，實施麻醉；以60w的白熾燈垂直距離50cm照射大鼠，在造模過程中始終保持大鼠肛溫在37±0.5℃；大鼠顱頂脫毛；3）在輔助工具幫助下,從大鼠尾靜脈注入微泡造影劑，注入量依照所述大鼠的體質量決定；4）超聲干預，啟動超聲設備，用超聲耦合劑將超聲探頭與大鼠的顱骨緊密結合，實施超聲干預，使微泡造影劑達到瞬間空化閾值；5）對大鼠行頭CT平掃，明確腦出血部位和出血量；6）以60w的白熾燈垂直距離50cm照射大鼠至少2h，保持大鼠肛溫在37±0.5℃；7）對大鼠神經功能評分，符合評分標準的大鼠即為造模成功大鼠，并飼養觀察待用。上述方案的進一步改進是：步驟3）中，微泡造影劑的注入量為0.1mL/kg。上述方案的進一步改進是：步驟4）中，超聲干預的頻率為2Mhz,能量為5-10W/cm2,作用時間120s。上述方案的進一步改進是：所述微泡造影劑為六氟化硫微泡。上述方案的進一步改進是：步驟2）中，用質量分數為10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，300—400mg/kg。上述方案的進一步改進是：步驟7）大鼠神經功能評分的方法采用如下的一種或多種，神經行為學檢查Longa評分法、Berderson評分法姿勢反射測驗、攀繩實驗、網屏測驗、肢體放置測驗、開野試驗法、MNSS、轉動桿測驗、Rotation、肢體對稱試驗評分法、rotarodtest、adhesive-removalsomatosensorytest、SpontaneousActivity、SymmetryintheMovementofFourLimbs、ForepawOutstretching、Climbing、BodyProprioception、ResponsetoVibrissaeTouch。上述方案的進一步改進是：神經功能評分過程，由至少3位參加試驗的人員分別以單盲法對試驗的大鼠進行打分和記錄.然后將至少3組的記分結果進行平均后的得分進行統計計算。本專利技術技術方案具有如下有益效果：本專利技術通過超聲靶向作用于造影劑，借助微泡瞬間空化效應，對腦內目標區局部血管產生破壞作用，使得大鼠出現腦實質內出血現象，符合自發性腦出血的研究要求，具有無創、簡便、易推廣的優點，是合適的可再現的生物造模方法。同時，還引入輔助設備，降低實施難度，使得操作更為簡便可行。具體實施方式本實施例的超聲聯合微泡建立大鼠腦出血模型的方法，造模過程中對動物的處置符合2009年《Ethicalissuesinanimalexperimentation》相關動物倫理學標準的條例；執行如下步驟：1）SPF級雄性SD大鼠一只，體質量240-270g；大鼠飼養環境：24℃恒溫，7:00-19:00開燈，晚間關燈，保持通風?？稍谠炷Ｇ?2h，對大鼠禁食、禁水，以便濃縮動物血液成分，使血液處于高凝狀態，容易形成血腫；設備器械準備；熒光顯微鏡：OLYMPUSBX51,日本；熒光數碼攝像頭：PenguinCamera150CL，Pixera，美國；圖像采集軟件：VIEWFINDER3.0,Pixera，美國；IMAGEPro-Plus4.5.0.19，MediaCybernetics，Inc，美國；視圖軟件：STUDIO3.0,MediaCybernetics，Inc，美國；圖像分析軟件專用圖像采集卡：IMAGEPro-Plus，MediaCybernetics，Inc，美國；圖像采集卡加密狗：SN:41N45000-34584,MediaCybernetics,Inc,美國；電腦：配有大內存的兼容電腦；超聲發生裝置：Sequoia512，Acuson，美國；TS-2超聲發生器，中國人明解放軍第一軍醫大學醫療儀器研制所，中國；恒溫循環器：HX-1050恒溫循環器，北京博益康實驗儀器有限公司，中國；透明本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.超聲聯合微泡建立大鼠腦出血模型的方法，其特征在于，執行如下步驟：/n1）SPF級雄性SD大鼠一只，體質量240-270g；/n2）準備工作；/n將大鼠固定于腦立體定位儀上，實施麻醉；以60w的白熾燈垂直距離50cm照射大鼠，在造模過程中始終保持大鼠肛溫在37±0.5℃；大鼠顱頂脫毛；/n3）在輔助工具幫助下,從大鼠尾靜脈注入微泡造影劑，注入量依照所述大鼠的體質量決定；/n4）超聲干預，啟動超聲設備，用超聲耦合劑將超聲探頭與大鼠的顱骨緊密結合，實施超聲干預，使微泡造影劑達到瞬間空化閾值；/n5）對大鼠行頭CT平掃，明確腦出血部位和出血量；/n6）以60w的白熾燈垂直距離50cm照射大鼠至少2h，保持大鼠肛溫在37±0.5℃；/n7）對大鼠神經功能評分，符合評分標準的大鼠即為造模成功大鼠，并飼養觀察待用。/n

【技術特征摘要】
1.超聲聯合微泡建立大鼠腦出血模型的方法，其特征在于，執行如下步驟：
1）SPF級雄性SD大鼠一只，體質量240-270g；
2）準備工作；
將大鼠固定于腦立體定位儀上，實施麻醉；以60w的白熾燈垂直距離50cm照射大鼠，在造模過程中始終保持大鼠肛溫在37±0.5℃；大鼠顱頂脫毛；
3）在輔助工具幫助下,從大鼠尾靜脈注入微泡造影劑，注入量依照所述大鼠的體質量決定；
4）超聲干預，啟動超聲設備，用超聲耦合劑將超聲探頭與大鼠的顱骨緊密結合，實施超聲干預，使微泡造影劑達到瞬間空化閾值；
5）對大鼠行頭CT平掃，明確腦出血部位和出血量；
6）以60w的白熾燈垂直距離50cm照射大鼠至少2h，保持大鼠肛溫在37±0.5℃；
7）對大鼠神經功能評分，符合評分標準的大鼠即為造模成功大鼠，并飼養觀察待用。


2.根據權利要求1所述的超聲聯合微泡建立大鼠腦出血模型的方法，其特征在于：步驟3）中，微泡造影劑的注入量為0.1mL/kg。


3.根據權利要求1所述的超聲聯合微泡建立大鼠腦出血模型的方法，其特征在于：所述微泡造影劑為六氟化硫微泡。


4.根據權利要求3所述的超聲聯合微泡建立大鼠腦出血模型的方法，其特征在于：步驟4）中，超聲干預的頻...

【專利技術屬性】
技術研發人員：范國峰，
申請(專利權)人：范國峰，
類型：發明
國別省市：江蘇;32