一種具有多等位基因p53編碼序列的重組腺病毒的制備方法技術

一種具有多等位基因p53編碼序列的重組腺病毒的制備方法，包括有如下步驟：采用寡核苷酸的第一DNA接頭修飾pUC18質粒，并將含有p53表達盒的片段克隆至修飾后質粒中，然后分別采用第二DNA接頭及第三DNA接頭修飾后得到的兩種質粒進行匹配產生具有p53等位基因雙拷貝的中間質粒，將中間質粒中的SpeI?SalI片段導入至穿梭質粒中，獲得p53等位基因雙拷貝的穿梭質粒將穿梭質粒pSTL?TDMp53(1+2)采用Pme1酶切使之線性化，然后和伙伴pAdEasy質粒一起通過電穿孔導入進宿主細菌，通過宿主細菌的細胞內進行同源重組，提取其含有p53編碼序列等位基因雙拷貝的表達盒和腺病毒骨架的質粒，然后通過電穿孔手段導入HEK?293細胞，產生具有p53編碼序列等位基因雙拷貝的重組腺病毒。

【技術實現步驟摘要】
一種具有多等位基因p53編碼序列的重組腺病毒的制備方法
本專利技術屬于基因工程
，涉及到一種具有至少雙等位基因p53編碼序列的重組腺病毒的制備方法。同一載體中p53等位基因的組合可能更有助于改善針對不同瘤種的治療效果，使其具有組織特異性，瘤種特異性乃至患者特異性。
技術介紹
p53基因是一種腫瘤抑制基因，已被廣泛作為各瘤種的互補或增強治療手段所采用，通常與化療、放療、免疫治療以及其他廣泛認可的療法聯用。當p53基因進入腫瘤時，基因表達為mRNA，進而翻譯為功能性蛋白。該蛋白產物預測大小為43.7kDa，但因其在凝膠電泳中出現在53kDa處，因此得名p53，這一現象是因為氨基酸殘基構成中有相對較多的脯氨酸殘基所致，同時，大規模的翻譯后修飾對于蛋白功能的表現也是必不可少的。p53基因編碼P53蛋白，它的全長表型由393個氨基酸殘基組成。也存在其它較短的p53表型，主要來源于mRNA產物的選擇性剪接。深圳市賽百諾基因技術有限公司自主研制開發的基因治療產品“重組人p53腺病毒注射液”(今又生，Gendicine)是世界上首個被批準上市的基因治療藥物，其本質是利用腺病毒和人p53基因拼裝得到的重組腺病毒。人的P53蛋白可對高危癌前病變的DNA損傷進行修復，對DNA損傷無法修復的細胞，P53蛋白則誘導其進入冬眠狀態或細胞凋亡?！癎endicine”的載體采用第一代人5型腺病毒，其基因不整合到宿主細胞基因組中，無遺傳毒性；載體經基因工程改造后，只對細胞實施一次感染，不能復制，無環境污染。>Gendicine的療效因腫瘤類型的不同而異，同樣的腫瘤類型患者之間也存在差異。這種現象被認為是由于不同癌癥類型中表達的基因組的組織特異性差異造成的，它們反過來又受到個體基因組成的影響，并進一步受到可能導致惡性腫瘤的環境因素的調節。因此，對治療的反應，包括對Gendicine的反應，可能因病例而異，我們尋求Gendicine其中攜帶的p53基因的最佳化學結構，以解決腫瘤細胞對其他細胞毒性效應的不良或有限反應。
技術實現思路
經過研究發現，p53基因的這種最佳化學結構有可以通過改變特定位置的氨基酸殘基和觀察其對生物活性的影響來確定。在腫瘤抑制的p53基因中，其72號密碼子存在一種常見的多態性，其編碼的氨基酸殘基要么是脯氨酸(Pro,P)，要么是精氨酸(Arg,R)，極少情況下也可以是亮氨酸(Leu,L)，這些為存在人體中的野生型p53基因。72號密碼子編碼氨基酸殘基被其它殘基替代時形成的變體型p53基因，可以使變體型p53基因的某些功能顯著增強，一個特定的氨基酸殘基替代就能顯著改善有利的p53功能，從而提高Gendicine在癌癥治療中的療效。突變研究表明野生型p53的脯氨酸富集結構域(PRD)，也正好是72號密碼子所在的區域，參與了細胞凋亡的有效誘導、致癌基因轉化的抑制、轉錄激活、促成p53與DNA結合等一系列功能。通過比較編碼脯氨酸Pro或精氨酸Arg及更多氨基酸的72號密碼子處的p53等位基因的活性，也可以明顯看出，它們的p53功能都存在顯著的差異，這表明72號密碼子有助于調節p53基因的活性?；谏鲜龅难芯堪l現，本專利技術的目的在于提供一種可以構建具有不同功能的等位基因p53編碼序列的重組腺病毒的制備方法，該方法構建的重組腺病即能增加p53表達量，還可以在增加p53表達的種類和功能。本專利技術的技術方案是提供一種具有p53編碼序列等位基因雙拷貝的重組腺病毒的制備方法，該方法包括有如下步驟：采用寡核苷酸的第一DNA接頭修飾pUC18質粒的SacI位點，使SacI位點轉換為SpeI位點，生成質粒pUC18_SpeI242；從含有p53基因的穿梭質粒pSTL-p53中純化含有p53表達盒的SpeI-SalI片段；將SpeI-SalI片段克隆至質粒pUC18_SpeI242中，生成質粒pSpeI-SalI_p53；采用寡核苷酸的第二DNA接頭修飾質粒pSpeI-SalI_p53的KpnI位點，使SacI位點轉換為NheI位點，生成質粒pSSp53KN，采用第一DNA片段取代位于pSSp53KN的PshAI和SgrAI位點之間，生成質粒pSSp53KN(1)采用寡核苷酸的第三DNA接頭修飾質粒pSpeI-SalI_p53的XmaI位點，使XmaI位點轉換為NheI位點，生成質粒pSSp53XN；采用第二DNA片段取代位于pSSp53KN的PshAI和SgrAI位點之間，生成質粒pSSp53KN(2)；將質粒pSSp53XN(1)與質粒pSSp53KN(2)進行匹配產生具有p53等位基因雙拷貝的中間質粒pUC_TDMp53(1+2)；將中間質粒pUC_TDMp53(1+2)中的SpeI-SalI片段導入至穿梭質粒pSTL-p53中，獲得p53等位基因雙拷貝的穿梭質粒pSTL-TDMp53(1+2)；將穿梭質粒pSTL-TDMp53(1+2)采用Pme1酶切使之線性化，然后和伙伴pAdEasy質粒一起通過電穿孔導入進宿主細菌，通過宿主細菌的細胞內進行同源重組，提取其含有p53編碼序列等位基因雙拷貝的表達盒和腺病毒骨架的質粒，然后通過電穿孔手段導入HEK-293細胞，產生具有p53編碼序列等位基因雙拷貝的重組腺病毒。本方法可以實現重組腺病毒中的雙拷貝p53等位基因構建，尤其是當希望同時表達具有不同功能的p53等位基因時，該方法構建的重組腺病毒即能增加p53表達量，還可以在增加p53表達的種類和功能。為了實現不同功能的p53等位基因的雙拷貝，其中的第一DNA片段和第二DNA片段分別為人工合成的DNA片段，包括可互補結合的通用對片段和可變對片段，其中的通用對片段的雙鏈序列如下：5’AGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAG3’3’TCCAGGTCTACTTCGAGGGTCTTACGGTCTCCGACGAGG5’其中的可變對片段的雙鏈序列如下：5’GCTGCTCCCNNNGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACA3’3’GMMMCACCGGGGACGTGGTCGTCGAGGATGTGGCC5’其中，NNN表示一個可變密碼子，MMM表示與NNN互補配對的反密碼子。在第一DNA片段和第二DNA片段當中，為了實現不同的功能的p53等位基因，分別改變這兩個DNA片段中的可變密碼子來達到，在構建后，這此可變密碼子對應的是p53等位基因中的第72號密碼子，即可以通過改變人工合成的這兩個DNA片段中的可變密碼子來實現重組腺病毒中的p53等位基因的第72號密碼子的改變，根據上述的研究，第72號密碼子的改變，表現的是不同功能的變化。為了不同的功能的實現，第一DNA片段和第二DNA片段中的可變密碼子NNN為表達不相同的氨基酸的不相同的密碼子，可變密碼子為如下密碼子中的任一種：CCT,CCA,CCG,CGT,CGA,CG本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種具有多等位基因p53編碼序列的重組腺病毒的制備方法，其特征在于，該方法包括有如下步驟：/n采用寡核苷酸的第一DNA接頭修飾pUC18質粒的SacI位點，使SacI位點轉換為SpeI位點，生成質粒pUC18_SpeI242；/n從含有p53基因的穿梭質粒pSTL-p53中純化含有p53表達盒的SpeI-SalI片段；/n將SpeI-SalI片段克隆至質粒pUC18_SpeI242中，生成質粒pSpeI-SalI_p53；/n采用寡核苷酸的第二DNA接頭修飾質粒pSpeI-SalI_p53的KpnI位點，使SacI位點轉換為NheI位點，生成質粒pSSp53KN，采用第一DNA片段取代位于pSSp53KN的PshAI和SgrAI位點之間，生成質粒pSSp53KN(1)/n采用寡核苷酸的第三DNA接頭修飾質粒pSpeI-SalI_p53的XmaI位點，使XmaI位點轉換為NheI位點，生成質粒pSSp53XN；采用第二DNA片段取代位于pSSp53KN的PshAI和SgrAI位點之間，生成質粒pSSp53KN(2)；/n將質粒pSSp53XN(1)與質粒pSSp53KN(2)進行匹配產生具有p53等位基因雙拷貝的中間質粒pUC_TDMp53(1+2)；/n將中間質粒pUC_TDMp53(1+2)中的SpeI-SalI片段導入至穿梭質粒pSTL-p53中，獲得p53等位基因雙拷貝的穿梭質粒pSTL-TDMp53(1+2)；/n將穿梭質粒pSTL-TDMp53(1+2)采用Pme1酶切使之線性化，然后和伙伴pAdEasy質粒一起通過電穿孔導入進宿主細菌，通過宿主細菌的細胞內進行同源重組，提取其含有p53編碼序列等位基因雙拷貝的表達盒和腺病毒骨架的質粒，然后通過電穿孔手段導入HEK-293細胞，產生具有p53編碼序列等位基因雙拷貝的重組腺病毒。/n...

【技術特征摘要】
1.一種具有多等位基因p53編碼序列的重組腺病毒的制備方法，其特征在于，該方法包括有如下步驟：
采用寡核苷酸的第一DNA接頭修飾pUC18質粒的SacI位點，使SacI位點轉換為SpeI位點，生成質粒pUC18_SpeI242；
從含有p53基因的穿梭質粒pSTL-p53中純化含有p53表達盒的SpeI-SalI片段；
將SpeI-SalI片段克隆至質粒pUC18_SpeI242中，生成質粒pSpeI-SalI_p53；
采用寡核苷酸的第二DNA接頭修飾質粒pSpeI-SalI_p53的KpnI位點，使SacI位點轉換為NheI位點，生成質粒pSSp53KN，采用第一DNA片段取代位于pSSp53KN的PshAI和SgrAI位點之間，生成質粒pSSp53KN(1)
采用寡核苷酸的第三DNA接頭修飾質粒pSpeI-SalI_p53的XmaI位點，使XmaI位點轉換為NheI位點，生成質粒pSSp53XN；采用第二DNA片段取代位于pSSp53KN的PshAI和SgrAI位點之間，生成質粒pSSp53KN(2)；
將質粒pSSp53XN(1)與質粒pSSp53KN(2)進行匹配產生具有p53等位基因雙拷貝的中間質粒pUC_TDMp53(1+2)；
將中間質粒pUC_TDMp53(1+2)中的SpeI-SalI片段導入至穿梭質粒pSTL-p53中，獲得p53等位基因雙拷貝的穿梭質粒pSTL-TDMp53(1+2)；
將穿梭質粒pSTL-TDMp53(1+2)采用Pme1酶切使之線性化，然后和伙伴pAdEasy質粒一起通過電穿孔導入進宿主細菌，通過宿主細菌的細胞內進行同源重組，提取其含有p53編碼序列等位基因雙拷貝的表達盒和腺病毒骨架的質粒，然后通過電穿孔手段導入HEK-293細胞，產生具有p53編碼序列等位基因雙拷貝的重組腺病毒。


2.根據權利要求1所述的具有多等位基因p53編碼序列的重組腺病毒的制備方法，其特征在于，
第一DNA片段和第二DNA片段分別包括可互補結合的通用對片段和可變對片段，其中的通用對片段的雙鏈序列如下：
5’AGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAG3’
3’TCCAGGTCTACTTCGAGGGTCTTACGGTCTCCGACGAGG5’
其中的可變對片段的雙鏈序列...

【專利技術屬性】
技術研發人員：迪奧斯達·德鮑蒂斯塔，徐衛，
申請(專利權)人：賽諾深圳生物醫藥研究有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44