抗人遷移刺激因子(MSF)及其用途制造技術

本發明專利技術涉及能識別和結合包含在人遷移刺激因子(MSF)序列中的表位，且不識別和結合人纖連蛋白1(hFn1)的抗體，以及在診斷方法和治療中的用途。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】抗人遷移刺激因子(MSF)及其用途
本專利技術涉及抗-MSF(遷移刺激因子)抗體，其醫藥用途及其在炎癥疾病特別是腫瘤的治療或預后方法中的用途。現有技術塑性是巨噬細胞的標志：接觸細胞因子或微生物產物，其獲得特定和不同的表型。M1和M2極化巨噬細胞是連續功能狀態的極端[1]。M1巨噬細胞介導對胞內病原體和腫瘤的抗性，而M2極化巨噬細胞發揮免疫調控性能并協調組織修復和重建。另外，M2巨噬細胞還在嚴重炎癥疾病，例如哮喘和過敏性疾病中，以及對寄生蟲的抗性中起作用[2]。在癌癥中，腫瘤相關巨噬細胞(TAM)是最廣泛的宿主炎癥細胞，而且是腫瘤微環境的必要組成[3-5]。TAM起到雙重作用：如預期的，一方面它們能引發抗腫瘤反應，但在大多數情況下其協調癌癥發作和進展的關鍵步驟[6-8]。接觸腫瘤衍生的產物后，TAM獲得M2樣表型，促使腫瘤增殖和進展，血管生成和淋巴血管生成，并抑制適應性免疫。在實驗模型中證實了巨噬細胞在腫瘤生長中的作用。在人類中，CD68+或CD163+TAM浸潤性實體瘤，例如乳癌和胰腺癌，和不良結果有關[9-11]。類似地，TAM數量增加與患有經典霍奇金氏淋巴瘤的患者中無進展存活縮短密切相關[12]。TAM靶向是經篩選的抗癌化合物的關鍵性質，例如曲貝替定(trabectedin)，一種EMA和FDA批準的抗腫瘤藥[13]。靶向巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF或CSF-1)途徑——巨噬細胞遷移、分化和存活的主要調節劑——的抗體或單個分子及其前體本身或與檢查點阻斷抑制劑一起正進行臨床評估[14]。因此，臨床前和臨床數據表明TAM是癌癥患者風險分級的可能生物標志，提供了TAM定向治療的原理保證[7,15-17]。如上所述，顯然需要合適的生物標志物來鑒定腫瘤物質內的TAM，以及確定作為治療靶標的M2極化巨噬細胞。M1和M2極化巨噬細胞以及M2樣TAM的基因分型揭示了一系列的M2極化細胞選擇性表達的基因[18]。這些分子之一是人纖連蛋白1(hFn1)的截短形式，稱作遷移刺激因子(MSF)[18,19](圖1)。人Fn1(SEQIDNo:1,NCBI登錄號AB191261.1，DNA；SEQIDNo:2,NCBI登錄號BAD52437.1，蛋白質)和MSF(SEQIDNo:3,NCBI登錄號AJ535086.1，DNA；SEQIDNo:4,NCBI登錄號CAH60958.1，蛋白質)的DNA和蛋白質序列如下所述。人MSF的cDNA與人纖連蛋白cDNA的5’端相同，直到包括外顯子III-1a，止于3’端獨特的195個核苷酸的序列。在轉錄和轉錄后水平上通過兩步機制控制MSF的表達。初始MSF轉錄物最初是由纖連蛋白基因通過分隔外顯子III-1a和III-1b的內含子通讀，然后通過內含子內切割產生5.9-kbMSF前-mRNA(轉錄水平)產生的。該前體被進一步切割，形成2.1-kb的成熟MSFmRNA,含有30-bp的框內編碼序列，延續到外顯子III-1a(轉錄后水平)。成熟mRNA迅速運到胞質，在此翻譯成與全長纖連蛋白的N端相同的70-kDa蛋白(直到和包括外顯子III-1a編碼的氨基酸序列),加入MSF-獨特的(內含子編碼的)長10個氨基酸的C末端(圖1)。MSF是胎兒期而不是正常成體細胞產生的癌胚分子。然而，不同的報道描述了癌癥相關的成纖維細胞和癌細胞的MSF產生。對此，專利技術人已經記錄了M2極化和腫瘤相關巨噬細胞(TAM，其具有M2樣表型，促進腫瘤增殖和進展，血管生成和淋巴血管生成以及抑制適應性免疫)中MSF產生[18]。WO9000567涉及遷移刺激因子-1，其是能刺激本身不產生該多肽的正常成體成纖維細胞遷移的多肽，聚丙烯酰胺凝膠電泳測得具有表觀分子量70kD，在生理pH下是陽離子，用10％飽和或更低的硫酸銨能從水溶液中沉淀出來，在pH2而不是pH10下在溶液中穩定，在56℃變性，易受胰蛋白酶和烷基化/還原的影響，且結合肝素。其他遷移刺激因子類似，但是陰離子的。其由來自癌癥病人的胚胎或胚胎樣成纖維細胞產生(但不是正常成體皮膚成纖維細胞)，其產生可用作各種癌癥的診斷或預后指征。本專利技術人對M2極化巨噬細胞產生MSF的觀察促使其調查是否MSF能被用作診斷和預后標志物。已記載了針對跨越前述人MSF的C末端尾的合成肽(即,VSIPPRNLGY[SEQIDNO:11])生成的小鼠單克隆抗體(即mAb7.1)[19,24]的產生。先前報道了抗體mAb7.1在斑點印跡設置中識別rhMSF[19]，但對于該抗體在ELISA中的應用還沒有數據。另外，基于現有的證據，該抗體的使用限于免疫組織化學過程[19,23,20]。因此，對于能在不同實驗設定中檢測MSF而不與纖連蛋白-1結合的抗體仍有需要。專利技術概述因此，專利技術人制備了一種小鼠單克隆抗體(稱作1G5.3)，其選擇性識別MSF并能有效定量具有與巨噬細胞M2極化有關的病理狀態的個體生物液中的MSF水平。該抗體是通過用重組人MSF(rhMSF)接種小鼠產生的，特異性識別特有的10個氨基酸長的蛋白C-末端尾(aa648-657)。在此，專利技術人揭示在斑點印跡和ELISA設置中當如上所述與已知抗體mAb7.1抗體(也稱作mabVSI7.1，報道于CancerRes.2005年12月1日；65(23):10742-9)比較對rhMSF及其C-末端(即生物素化合成肽形式，biot-VSIPPRNLGY[SEQIDNO:11][MSF特異性的十肽(SEQIDNO:4的aa.648-657，其含有通過氨基己酸(Ahx)臂與NH2末端連接的生物素部分biot-Ahx-VSIPPRNLGY)的結合時,只有本專利技術的抗體在典型ELISA條件下識別biot(生物素化)-VSIPPRNLGY(SEQIDNO:11)肽(即MSF的C-端特有尾)和rhMSF。而且，本專利技術的抗體以劑量依賴形式在調理培養基中以及作為純化分子都識別biot-VSIPPRNLGY(SEQIDNO:11)肽和rhMSF。另外，本專利技術的純化抗體在斑點印跡實驗中特異性檢測rhMSF，其將該抗體的應用范圍擴大到了斑點印跡。這些結果表明，本專利技術的抗體在不同實驗設置下，最重要的是在測定生物液中的MSF水平的ELISA免疫試驗中具有獨特的識別MSF的能力。專利技術詳述本專利技術的作者制備了一種單克隆抗體稱作1G5.3,其用重組人MSF(rhMSF)免疫BALB/c小鼠獲得。用間接ELISA根據抗體與rhMSF結合的特異性和選擇性選擇分泌該抗體的雜交瘤克隆。用所選雜交瘤制備的抗體實際上不識別hFn1。因此，本專利技術的一個目的是一種能識別和結合人遷移刺激因子(MSF)的序列VSIPPRNLGY(SEQIDNo:4的aa648到aa.657[SEQIDNO:11])中所包含的表位，且不識別和結合人纖連蛋白1(hFn1)的抗體。優選地，所述表位由人遷移刺激因子(MSF)的序列VSIPPRNLGY(SEQIDNo:4的aa.648到aa657(SEQIDNO:11))組成。本專利技術的另一個目的是能識別和結合人遷移刺激因子(MSF)，且不識別和結合人纖本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種能識別和結合人遷移刺激因子(MSF)中序列VSIPPRNLGY(SEQ ID NO:11)所包含表位，而不能識別和結合人纖連蛋白1(hFn1)的抗體。/n

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】20170919 IT 1020170001047361.一種能識別和結合人遷移刺激因子(MSF)中序列VSIPPRNLGY(SEQIDNO:11)所包含表位，而不能識別和結合人纖連蛋白1(hFn1)的抗體。


2.如權利要求1所述的抗體，其中表位由人遷移刺激因子(MSF)的序列VSIPPRNLGY(SEQIDNO:11)組成。


3.如權利要求1或2所述的抗體，特征是其是利用序列VSIPPRNLGY(SEQIDNO:11)的肽獲得和/或所述抗體選自IgG、IgM、IgA和IgE抗體。


4.如前述權利要求中任一項所述的抗體，其能在免疫試驗，優選酶聯免疫吸附試驗(ELISA)中識別和結合MSF。


5.如前述權利要求中任一項所述的抗體，包含：
-重鏈的互補決定區3(CDRH3)，與氨基酸序列WDY(SEQIDNO:12)具有至少80％相同性，和/或
-輕鏈的互補決定區3(CDRL3)，與氨基酸序列QSYNLHT(SEQIDNO:15)具有至少80％相同性。


6.如前述權利要求中任一項所述的抗體，包含：
-重鏈的互補決定區3(CDRH3)，包含序列SEQ.IDNo.12，和/或
-輕鏈的互補決定區3(CDRL3)，包含序列SEQ.IDNo.15。


7.如前述權利要求中任一項所述的抗體，包含：
-重鏈的互補決定區3(CDRH3)，與氨基酸序列WDY(SEQIDNO:12)具有至少80％相同性，優選所述CDRH3包含SEQIDNO.12，和/或
-重鏈的互補決定區2(CDRH2)，與氨基酸序列EIRMKSDNYATYYAESVKG(SEQIDNO:13)具有至少80％相同性，優選所述CDRH2包含SEQIDNO.13，和/或
-重鏈的互補決定區1(CDRH1)，與氨基酸序列NDWMN(SEQIDNO:14)具有至少80％相同性，優選所述CDRH1包含SEQIDNO.14，和/或
-輕鏈的互補決定區3(CDRL3)，與氨基酸序列QSYNLHT(SEQIDNO:15)具有至少80％相同性，優選所述CDRL3包含SEQIDNO.15，和/或
-輕鏈的互補決定區2(CDRL2)，與氨基酸序列WASTRYS(SEQIDNO:16)具有至少80％相同性，優選所述CDRL2包含SEQIDNO.16，和/或
-輕鏈的互補決定區1(CDRL1)，與氨基酸序列RSSHYLLNSRTRKNFLS(SEQIDNO:17)具有至少80％相同性，優選所述CDRL1包含SEQIDNO.17。


8.如前述權利要求中任一項所述的抗體，其包含重鏈可變區，其包含與以下氨基酸序列具有至少80％相同性的序列：EVKIEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNDWMNWVRQSPEKGLEWV
AEIRMKSDNYATYYAESVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNNLRAEDNGIYYCTSWDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNO:18)和/或
輕鏈可變區，其包含與以下氨基酸序列具有至少80％相同性的序列：DIVMSQSPSSLAVSTGEKVTMNCRSSHYLLNSRTRKNFLSWYQQKPG
QSPQLLIYWASTRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLHTFGGGTKLEIK(SEQIDNO:19)。


9.如前述權利要求中任一項所述的抗體，包含：
-重鏈可變區，包含以下氨基酸序列：
EVKIEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNDWMNWVRQSPEKGLEWV
AEIRMKSDNYATYYAESVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNNLRAEDNGIYYCTSWDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNO:18)和/或
-輕鏈可變區，包含以下氨基酸序列：
DIVMSQSPSSLAVSTGEKVTMNCRSSHYLLNSRTRKNFLSWYQQKPG
QSPQLLIYWASTRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLHTFGGGTKLEIK(SEQIDNO:19)，
優選包含主要由SEQIDNo.6的氨基酸序列組成的重鏈和/或主要由SEQIDNo.8的氨基酸序列組成的輕鏈。


10.能夠識別和結合前述權利要求所述的抗體識別的表位，且不識別和結合人纖連蛋白1(hFn1)的抗體。


11.如前述權利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體選自以下：單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、去免疫化抗體、全人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、雙抗體、scFv、Fab、F(ab)’2及其二聚、寡聚或多聚物。


12.一種選擇性檢測和/或測定蛋白質MSF或其片段的體外或離體方法，包括步驟：在從個體獲得的分離的生物樣品中檢測MSF或其片段，通過能識別和結合人遷移刺激因子(MSF)的序列VSIPPRNLGY(SEQIDNO:11)中包含的表位，而不識別和結合人纖連蛋白1(hFn1)的配體，優選所述配體是抗體，更優選所述抗體是權利要求1-11中任一項所述的抗體。


13.一種在個體內對癌癥或炎癥病狀，優選哮喘或過敏評估風險和/或診斷和/或預后和/或監測進展和/或監測治療處理的效果和/或篩選治療處理的體外或離體方法，包括步驟：
a)在獲自個體的分離生物樣品中檢測或測定蛋白質MSF或其片段，或編碼所述蛋白質或其片段的多核苷酸的量或活性，和

【專利技術屬性】
技術研發人員：A·曼托瓦尼，B·博塔茲，I·拉菲斯，A·英弗扎托，T·古力可，
申請(專利權)人：博愛米拉索勒股份公司，米蘭大學，
類型：發明
國別省市：意大利;IT