本發明專利技術涉及卡介菌多糖核酸在CIK細胞體外培養及制備腫瘤藥物中的應用，是將卡介菌多糖核酸加入至CIK細胞體外培養的培養體系中。經卡介菌多糖核酸培養后的CIK細胞有明顯的誘導增殖作用，CD3和CD56雙陽性顯著提高，且誘導培養后的CIK細胞對腫瘤生長有較強的殺傷作用。因此具有極高的臨床應用價值，特別是為腫瘤治療藥物的研制提供了新的方式。
【技術實現步驟摘要】
卡介菌多糖核酸在CIK細胞體外培養及制備腫瘤藥物中的應用
本專利技術涉及中藥應用
，具體的說是涉及卡介菌多糖核酸在CIK細胞體外培養及制備腫瘤藥物中的應用。
技術介紹
細胞過繼免疫治療是目前的研究熱點，它是將體外激活的自體或異體免疫效應細胞輸注給患者，殺滅患者體內的腫瘤細胞，并在此基礎上修復、完善機體免疫系統的生物治療方法。CIK細胞(cytokine-induced-killercells)是一群在體外經過多種細胞因子共同誘導，能夠同時表達兩種膜蛋白分子即CD3和CD56的異質細胞，它不僅具有自然殺傷細胞的非主要組織相容性復合物(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)限制性殺瘤特點，還具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性，具有重要的免疫治療臨床應用價值。因此，CIK細胞的體外大量增殖，即提高其體外增殖速率和對腫瘤細胞的殺傷力，是大規模使用CIK細胞免疫治療的關鍵所在。卡介菌的主要成分包括脂類、多糖、蛋白和核酸，其中多糖(包括脂類)和核酸組分發揮著重要的生理功能。卡介菌的細胞壁的主要成分由多糖(主要包括肽聚糖、阿拉伯半乳糖聚糖和分支菌酸，)和脂類構成。研究表明：可結合人和動物的Toll受體(TLR)的配體大量存在卡介菌細胞壁和其他細胞器上，而且這些配體至少可結合5種Toll受體(TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR9)，這些配體和Toll受體結合后會促進樹突狀細胞的成熟，并誘導IL-12的分泌，而IL-12不僅能分泌IFN-γ而且能促進Th0細胞向Th1細胞亞群轉化，從而產生Th1占優勢的非特異性免疫反應。
技術實現思路
利用卡介菌多糖核酸有機地結合CIK細胞免疫治療在腫瘤治療中的強大優勢，建立卡介菌多糖核酸促進免疫細胞的大量增殖和提高殺傷力的工藝體系，從而間接改善腫瘤患者的生活質量，延長生存期。本專利技術目的在于提供最優卡介菌多糖核酸提取液濃度在提高CIK細胞增殖速率、CD3和CD56雙陽性和對腫瘤殺傷力方面的應用。本專利技術提供了一種促進CIK細胞增殖分化的卡介菌多糖核酸。采用卡介菌菌體破碎和熱酚處理獲得的卡介菌多糖核酸。本專利技術提供了一種CIK細胞培養基，包括基礎培養基和卡介菌多糖核酸。進一步地，所述卡介菌多糖核酸在培養基中的含量為0.35～35μg/mL。優選的，所述卡介菌多糖核酸在培養基中的含量為35μg/mL。進一步地，所述基礎培養基選自RPM1640培養基、DMEM培養基或MEM培養基。進一步地，所述培養基中還包括IFN-γ和CD3單抗。本專利技術提供了一種CIK細胞培養的方法，包括(1)制備CIK細胞的出發細胞；(2)配制含卡介菌多糖核酸的培養基，并添加入步驟(1)中的出發細胞，經培養獲得CIK細胞。進一步地，所述卡介菌多糖核酸在培養基中的含量為0.35～35μg/mL。優選的，所述卡介菌多糖核酸在培養基中的含量為35μg/mL。進一步地，所述培養基中還包括IFN-γ和CD3單抗。進一步地，步驟(2)的方法包括37℃，5％CO2培養箱內培養7d，定期更換1/2對應培養液。本專利技術還提供了介菌多糖核酸在促CIK細胞增殖分化中的應用。本專利技術還提供了利用介菌多糖核酸制備方法制得的CIK細胞在制備腫瘤治療藥物中的應用。更進一步地，所述卡介菌多糖核酸的制備方法包括以下步驟：1)菌體培養：將液體低溫保藏的菌種于室溫下溶解，接種于馬鈴薯蘇通培養基，37℃下連續培養14-20天。2)菌體收集：待菌體生長至對數期后，收集培養瓶內的菌膜，加入適量去離子蒸餾水洗滌，壓干后備用。3)菌體破碎和熱酚處理：將收集的菌體按10:1的比例加入去離子蒸餾水，以組織搗碎勻漿機(12000rpm/min)破碎菌體，每次3min，共3次，將菌體搗碎，然后再加入破碎菌懸液0.5-2.0倍體積量的熱苯酚(30-100℃)，在低速攪拌中保溫30分鐘-1小時。4)卡介菌多糖核酸混合物的提取：將熱酚處理好的混合液自然沉淀1-10天，吸取上清液，管式離心機高速離心后，上清經0.45μm無菌濾器過濾，即為卡介菌多糖核酸混合物。5)在所收集的卡介菌多糖核酸提取液中加入藥用乙醇進行醇沉，含醇量為70-75％。自然沉淀4天后，收集沉淀物。沉淀物通過無水乙醇充分攪拌均勻、離心洗滌3次，然后用乙醚洗滌離心3次后，放至50℃真空干燥器干燥，干燥物即為卡介菌多糖核酸提取物。本專利技術的有益效果是：(1)本專利技術所述的卡介菌多糖核酸與其他化學誘導增殖因子相比，符合細胞培養要求，即對人體無毒副作用，故誘導增殖后的CIK細胞直接可以用于臨床試驗。(2)與相應的多糖刺激因子相比，本專利技術所述的多糖提取方法精練，劑型先進，該多糖提取液功效明顯，成分明確，質量可控。(3)本專利技術所述的卡介菌多糖核酸具有明顯提高CIK細胞增殖速率的作用，CD3和CD56雙陽性顯著提高，激活后的細胞殺傷力明顯高于對照CIK細胞處理。附圖說明圖1卡介菌多糖核酸不同濃度誘導細胞增值趨勢圖。圖2最優濃度卡介菌多糖核酸誘導后CIK細胞對腫瘤的殺傷力評價。具體實施方式下面結合具體附圖對本專利技術進行詳細的說明。這些具體的實施例僅僅是在不違背本專利技術精神下的有限列舉，并不排除本領域的一般技術人員把現有技術和本專利技術結合而產生的其他具體的實施方案，或者利用已有的臨床中藥注射劑而產生的其他具體的實施方案。主要材料的準備。一種對CIK細胞增殖分化有明顯提高作用的卡介菌多糖核酸，其方法步驟如下：(1)將液體低溫保藏的菌種室溫下溶解，接種于馬鈴薯蘇通培養基，連續培養14-20天。(2)待菌體生長至對數期后，收集菌膜，洗滌，壓干。(3)以組織搗碎勻漿機破碎收集的菌體，經熱苯酚，在低速攪拌中保溫處理。(4)將熱酚處理好的混合液自然沉淀，吸取上清液，離心后過濾除菌，即為卡介菌多糖核酸混合物。(5)將所收集的卡介菌多糖核酸提取液進行醇沉，自然沉淀4天后，收集沉淀物。沉淀物通過無水乙醇充分攪拌均勻、離心洗滌后，真空干燥器干燥，干燥物即為卡介菌多糖核酸提取物。(6)精密稱取經真空干燥的卡介菌多糖核酸加水溶解，定容，所配得的溶液即為卡介菌多糖核酸溶液。實施例l卡介菌的培養和收獲1.菌體培養：將液體低溫保藏的菌種(中國卡介苗制備用卡介菌株D2PB302，中國藥品生物制品檢定所)室溫下溶解，接種于馬鈴薯蘇通培養基，37℃：連續培養14-20天。其中，馬鈴薯蘇通培養基的制備方法可以是：(1)取洗凈新鮮土豆(1個)，用穿刺器穿成圓柱，再用刀切成4公分長斜面；用流動飲用水沖洗土豆斜面1小時，再用純化水沖洗土豆斜面塊；用蘇通培養基沖洗斜面塊，取蘇通培養基20ml，加入100ml滅菌大管中；(2)將沖洗后的土豆斜面放入裝有蘇通培養基的滅菌大管中；(3)0.11MPa的大氣壓121℃，滅菌20分鐘。放冷至室溫待接種。...
【技術保護點】
1.卡介菌多糖核酸在體外培養CIK細胞中的應用，其特征在于，將卡介菌多糖核酸加入至CIK細胞體外培養的培養體系中。/n
【技術特征摘要】
1.卡介菌多糖核酸在體外培養CIK細胞中的應用，其特征在于，將卡介菌多糖核酸加入至CIK細胞體外培養的培養體系中。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，卡介苗多糖核酸的添加量是1ml培養體系中含0.35μg-35μg的卡介菌多糖核酸。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，卡介苗多糖核酸的添加量是1ml培養體系中含35μg的卡介菌多糖核酸。
4.用于CIK細胞體外培養的培養基，包括基礎培養基，其特征在于，還包括卡介菌多糖核酸。
5.根據權利要求4所述的培養基，其特征在于，培養基中卡介苗多糖核酸的添加量是1ml培養基中含0.35μg-35μg的卡介菌多糖核酸。
6.根據權利要求5所述的培養基，其特征在于，培養...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳春，楊連陽，
申請(專利權)人：中國計量大學，
類型：發明
國別省市：浙江;33
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