【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】生物分子偶聯物及其用途
本專利技術涉及到一種生物分子偶聯物及其用途。
技術介紹
通過天然胱氨酸將偶聯劑與抗體連接的廣泛應用已經進一步推廣了抗體的使用。諸如毒素或者藥物分子已經通過與抗體偶聯形成藥物-抗體偶聯物。通過將可切割的掩蔽肽序列與抗體融合形成可在腫瘤局部激活的前體已經得到應用。但是肽僅限于連接在抗體的末端，且受掩蔽肽的影響，激活序列的激活效率降低，偶聯復合物免疫原性升高。目前商業化大分子藥物的共同副反應是免疫毒性。包括：免疫抑制、產生免疫原性、過敏癥、自動反應、不良免疫刺激。這些副反應主要是由外來大分子引起。進入體內后，異質大分子由于其免疫原性，將在患者中引發免疫應答。在正常組織中，經過大分子藥物治療，還會刺激免疫力并產生自身免疫反應。例如抗體或細胞因子，與抗原或者受體結合。此時對患者來說非常危險。例如，在用目前的PD-1抗體，可瑞達和歐狄沃治療非小細胞肺癌期間，可能發生嚴重的肺炎，甚至可能導致患者死亡。在CTLA4抗體(yervoy)，41BB，IL-2，IL-10等的臨床應用中也報道了類似的效果。在歐狄沃和Yervoy聯合治療非小細胞肺癌的過程中，55％的患者表現出高達的3-4級AE，36％的患者由于藥物毒性而不得不停止藥物治療。因此，該領域需要具有新功能的智能生物分子偶聯物，通過阻斷血液和正常組織中的藥物活性來降低總體毒性和免疫毒性，并增強病理微環境中的活性藥物，調節血清中的DMPK和半衰期，降低抗體Fab的免疫原性，調節活性生物分子的親合力，提高療效。
技術實現思路
...
【技術保護點】
1.一個生物分子偶聯物有以下結構：/nR1-R2-R3-R4-S-Cys-R5/n其中，/nR5代表一個通過突變誘導一個或多個半胱氨酸殘基的生物分子；/nCys代表包含在R5里的半胱氨酸殘基；/nS代表半胱氨酸殘基上的硫原子；/nR1是一個阻止R5與它的配體或受體結合的基團；/nR2不存在，或者是一個可切割的連接臂，其可以一個或多個蛋白水解酶激活或者是一個可以在病理微環境中被酸性激活的一個化學鍵；/nR3不存在，或者可以說是一個可以自動脫落的連接臂在R2被切割或者R2在病理微環境被酸激活之后；當R2不存在時，R3是一個可以在病理微環境被酸激活的一個化學鍵；/nR4是一個可以與R5包含的半胱氨酸殘基里的硫原子共價結合的基團，其作用是當R1-R2-R3被切割后，維持或者提高R5與其抗原的結合能力。/n
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】20171108 US 62/583,4101.一個生物分子偶聯物有以下結構：
R1-R2-R3-R4-S-Cys-R5
其中，
R5代表一個通過突變誘導一個或多個半胱氨酸殘基的生物分子；
Cys代表包含在R5里的半胱氨酸殘基；
S代表半胱氨酸殘基上的硫原子；
R1是一個阻止R5與它的配體或受體結合的基團；
R2不存在，或者是一個可切割的連接臂，其可以一個或多個蛋白水解酶激活或者是一個可以在病理微環境中被酸性激活的一個化學鍵；
R3不存在，或者可以說是一個可以自動脫落的連接臂在R2被切割或者R2在病理微環境被酸激活之后；當R2不存在時，R3是一個可以在病理微環境被酸激活的一個化學鍵；
R4是一個可以與R5包含的半胱氨酸殘基里的硫原子共價結合的基團，其作用是當R1-R2-R3被切割后，維持或者提高R5與其抗原的結合能力。
2.權利要求1中所描述的生物分子偶聯物，其中R1選自包含聚乙二醇-C1-5-烷基羰基的基團，
其中每個R獨立地是C1-4烷基；每個n獨立地是1至30000范圍內的整數，例如1至15000，1至5000，1至2000，1至300，1至150，1至50，1至20的整數或3至12；聚乙二醇或Pegm表示分子量為44至132000的聚乙二醇，例如1000至50000或10000至30000的聚乙二醇；m表示聚乙二醇的分子量；波浪線表示連接R2的R1的位置。
3.據權利要求1所述的生物分子偶聯物，其中R1篩選自以下基團：
4.根據權利要求5所述的生物分子的偶聯物，其中R2是能夠被一種或多種蛋白水解酶，蛋白酶或肽酶活化或裂解的肽，其中所述蛋白酶選自半胱氨酸蛋白酶，天冬酰胺蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，谷氨酸蛋白酶，蘇氨酸蛋白酶，明膠酶，金屬蛋白酶或天冬酰胺肽裂解酶；優選地，R2是能夠被至少一種選自下組的酶切割的肽：天冬酰胺內肽酶，顆粒酶，組織蛋白酶B，組織蛋白酶C，組織蛋白酶D，組織蛋白酶E，組織蛋白酶K，組織蛋白酶L，激肽釋放酶，hK1，hK10，hK15，纖溶酶，膠原酶，IV型膠原酶，星形膠質素，Xa因子，胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶，胰蛋白酶樣蛋白酶，彈性蛋白酶樣蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶，獼猴桃蛋白酶，菠蘿蛋白酶，鈣蛋白酶，半胱天冬酶，半胱天冬酶-3，Mirl-CP，木瓜蛋白酶，HIV-1蛋白酶，HSV蛋白酶，CMV蛋白酶，凝乳酶，肽酶，間質蛋白酶，血漿蛋白酶，豬籠草蛋白酶，金屬外肽酶，金屬內肽酶，基質金屬蛋白酶(MMP)，MMP1，MMP2，MMP3，MMP8，MMP9，MMP10，MMP11，MMP12，MMP13，MMP14，ADAM10，ADAM12，尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)，腸內激酶，前列腺特異性抗原(PSA，hK3)，白細胞介素-113轉換酶，凝血酶，FAP(FAP-a)，跨膜肽酶，二肽基肽酶和二肽基肽酶四(DPPIV/CD26)。
5.根據權利要求1的生物分子的偶聯物，其中R2是由-R2a，-R2b-，-R2a-N-，-R2a-D-，-R2a-AAN-，-R2a-AAD-代表的肽，或-R2a-R2b-；其中R2a是能夠通過一種或多種蛋白水解酶在酰胺鍵上裂解的肽；R2b是在側鏈上具有氮的肽，與R3形成氨基甲酸酯，其中氨基甲酸酯能夠被一種或多種蛋白水解酶切割；A是丙氨酸；N是天冬酰胺，其側鏈中的氮與R3形成氨基甲酸酯，其中氨基甲酸酯是能夠的由天冬酰胺內肽酶切斷；D是天冬氨酸，其側鏈中的氮與R3形成氨基甲酸酯，氨基甲酸酯可被粒酶B裂解；
優選地，R2是三肽，其中與R1連接的三肽的第一個氨基酸殘基選自Ala，Thr，Val和Ile，中間的第二個氨基酸殘基選自Ala，Thr，Val和Asn，以及第三個氨基酸與R3連接的酸殘基選自Asn和Asp；其中R2以酰胺，酯，氨基甲酸酯，脲或腙鍵的連接方式通過第一個氨基酸殘基的氨基與R1連接，并通過第三個氨基酸殘基的羧基以酰胺，酯，氨基甲酸酯，尿素或腙鍵連接方式與R3連接；優選地，三肽選自Ala-Ala-Asn和Ala-Ala-Asp。
6.根據權利要求1所述的生物分子的偶聯物，其中R2是在病理微環境的酸性條件下可裂解的鍵，并且選自酰胺，酯，氨基甲酸酯，脲和腙鍵；優選地，其中R1-R2-R3-R4的結構由下式表示：
其中X和Y各自獨立地為NR'或O，Z為H或C1-10烷基，R'為H或C1-4烷基；R3分別以酰胺，酯，氨基甲酸酯，脲或腙鍵的連接方式通過X和Y與R1和R4連接。
7.根據權利要求1的生物分子的偶聯物，其中R2是在病理微環境的酸性條件下可裂解的鍵，并且選自酰胺，酯，氨基甲酸酯，脲和腙鍵，其中R1-R2-R3-R4的結構由下式表示：
8.根據權利要求1的生物分子的偶聯物，其中R3選自：
其中X和Y各自獨立地為NR'或O，Z為H或C1-10烷基，R為C1-4烷基，R'為H或C1-4烷基；其中R4以酰胺，酯，氨基甲酸酯，脲或腙鍵的連接方式通過上式中的Y或N與R3連接。
9.根據權利要求8的生物分子的偶聯物，其中R3選自-NH-苯基-CH2O-，-NH-苯基-CH＝N-，-NH-苯基-C(CH3)＝N--O-苯基-CH＝N-和-O-苯基C(CH3)＝N-。
10.根據權利要求1的生物分子的偶聯物，其中R3選自酰胺，酯，氨基甲酸酯，脲和腙鍵。
11.根據權利要求1所述的生物分子的偶聯物，其中R3選自：
12.根據權利要求1的生物分子的偶聯物，其中R4由-R4-a-R4-b-R4-c-表示，其中R4-a選自：
其中Ra和Rb各自獨立地選自H和C1-6烷基或C1-6烷氧基；
R4-b選自：
其中在式R4-b1中，Rc不存在，或選自C1-12烷基，C1-12烷氧基-C1-12烷基，C1-12烷基-C3-8環烷基，(C1-4烷基-O)p-C1-12烷基，C1-12烷基羰基氨基-(C1-4烷基-O)p-C1-12烷基，苯基-C1-12烷基，C3-8環烷基，C1-12烷基-C3-8環烷基-C1-12烷基和C1-12烷基-苯基-C1-12烷基；在式R4-b2中，Rc是C1-12烷基氨基，其中Ra-1和Ra-2在氨基的N原子上被取代，并且在式4-b3中，Rc是C1-12烷基，最后的C原子在末端烷基被Ra-1，Ra-2和Ra-3取代，其中Ra-1，Ra-2和Ra-3各自獨立地選自C1-12烷基，C1-12烷基-OH和C1-12烷基-NR”R”'，其中R”和R”’各自獨立地選自H和C1-12烷基；其中，在式R4-b2和R4-b3中，R4-b通過Ra-1，Ra-2和Ra-3中的至少一個與R4-c連接；
R4-c選自：
其中Rx選自H，鹵素和C1-4烷基；p是1至10的整數，例如1至5的整數；q為1～4的整數，例如1～2的整數；條件是當R4-a選自式R4-a2，R4-a3和R4-a4時，R4-c不存在；
其中R3通過R4的R4-c連接到R4，并且R4-a的每個式中所示的波浪線表示R4-a與R4-b連接的位置。
13.根據權利要求1所述的生物分子的偶聯物，其中R4選自：
14.根據權利要求1所述的生物分子的偶聯物，其中R5是其一個或多個氨基酸突變為半胱氨酸的蛋白質，并且R5通過半胱氨酸的硫醇基團與R4連接；優選地，R5是其一個或多個氨基酸突變為半胱氨酸的抗體。
15.根據權利要求1所述的生物分子的偶聯物，其中R5是抗體，并且所述突變位于抗體分子的可變區的非互補決定區中；優選地，生物分子的偶聯物最終通過偶聯獲得的分子量增加超過200。
16.根據權利要求14的生物分子的偶聯物，其中R5代表細胞因子，其蛋白質序列中的一個或多個氨基酸突變為半胱氨酸。
17.根據權利要求14的生物分子的偶聯物，其中R5代表在抗體分子的可變區的互補決定區中具有一個或多個突變的抗體，優選地，R5代表具有選定的一個或多個氨基酸殘基的抗體；選自由突變為半胱氨酸的互補決定區中的G，A，S，T，L，I，F，E，K，D和Y組成的組。
18.根據權利要求14的生物分子的偶聯物，其中R5代表在抗體可變區的非互補決定區中具有一個或多個突變的抗體，優選地，R5代表具有一個或多個氨基酸殘基的抗體，所述氨基酸殘基選自由G，A，S，T，L，I，F，E，K，D和Y組成的非互補決定區，其突變為半胱氨酸。
19.根據權利要求16所述的生物分子的偶聯物，其中所述生物分子是具有一個或多個選自G，A，S，T，L，I，F，E，K，D和Y的氨基酸殘基突變為半胱氨酸的細胞因子。
20.根據權利要求14所述的生物分子的偶聯物，其中R5代表在所述抗體的可變區的非互補決定區中具有一個或多個突變的抗體，優選地，在VH的非互補決定區中具有Gln3，Ser7，Ser26，Glu46，Thr68，Asp72和在VL的非互補決定區中的Thr5，Tyr49，Arg61，Ser63，Ser65，Ser67，Thr72，Thr74，Ser76，Asp82中的一種或多種突變為半胱氨酸。
21.根據權利要求14所述的生物分子的偶聯物，其中在突變之前，R5對應于選自IL-2，IL-7，IL-10，IL-11，IL-12，IL-15，IL-21，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，G-CSF，GM-CSF，TNF-α，TRAP和TRAIL的生物分子；
R5對應于選自抗Her2抗體，抗EGFR抗體，抗VEGFR抗體，抗CD20抗體，抗CD33抗體，抗PD-L1抗體，抗PD-1抗體，抗CTLA-4抗體，抗TNFα抗體，抗CD28抗體，抗4-1BB抗體，抗OX40抗體，抗GITR抗體，抗CD27抗體，抗CD40抗體或抗ICOS抗體，抗CD25抗體，抗CD30抗體抗體，抗CD3抗體，抗CD22抗體，抗CCR4抗體，抗CD38抗體，抗CD52抗體，抗補體C5抗體，RSV的抗F蛋白，抗GD2抗體，抗GITR抗體，抗糖蛋白受體lib/Illa抗體，抗ICOS抗體，抗IL2R抗體，抗LAG3抗體，抗整合素α4抗體，抗lgE抗體，抗PDGFRa抗體，抗RANKL抗體，抗SLAMF7抗體，抗LTIGIT抗體，抗TIM-3抗體，抗VEGFR2抗體，抗VISTA抗體的抗體或其功能片段；
R5對應于選自下組的抗體或其功能片段：Utomilumab，Urelumab，ADG106，PoteligeoTM(Mogamulizumab)，PoteligeoTM(Mogamulizumab)，BexxarTM(tositumomab)，ZevalinTM(ibritumomabtiuxetan)，RituxanTM(利妥昔單抗))，ArzerraTM(Ofatumumab)，GazyvaTM(Obinutuzumab)，BesponsaTM(Inotuzumabozogamicin)，ZenapaxTM(daclizumab)，Varlilumab，Theralizumab，AdcetrisTM(Brentuximabvedotin)，MyelotargTM(gemtuzumab)，DarzalexTM(Daratumumab)，CDX-1140，SEA-CD40，RO7009789，JNJ-64457107，APX-005M，ChiLob7/4，CampathTM(alemtuzumab)，RaptivaTM(efalizumab)，SolirisTM(依庫麗單抗)，YervoyTM(ipilimumab)，tremelimumab，ErbituxTM(西妥昔單抗)，VectibixTM(帕尼單抗)，PortrazzaTM(Necitumumab)，TheraCIMTM(尼妥珠單抗)，SynagisTM(帕利珠單抗)，UnituxinTM(Dinutuximab)，TRX-518，MK-4166，MK-1248，GWN-323，INCAGN0186，BMS-986156，AMG-228，ReoProTM(abiciximab)，HerceptinTM(曲妥珠單抗)，PerjetaTM(Pertuzumab)，KadcylaTM(Ado-trastuzumabemtansine)，GSK-3359609，JTX-2011，SimulectTM(巴利昔單抗)，TysabriTM(那他珠單抗)，BMS-986016，REGN3767，LAG525，XolairTM(omalizumab)，Tavolimab，PF-04518600，BMS-986178，MOXR-0916，GSK-3174998，INCAGN01949，IBI-101，KeytrudaTM(Pembrolizumab)，OpdivoTM(Nivolumab)，LartruvoTM(Olaratumab)，TencentriqTM(Atezolizumab)，BMS-936559，BavencioTM(Avelumab)，ImfinziTM(Duralumab)，ProliaTM(Denosumab)，EmplicitiTM(Elotuzumab)，MTIG7192A，TSR-022，MBG-453，RemicadeTM(英夫利昔單抗)，HumiraTM(阿達木單抗)，AvastinTM(貝伐單抗)，LucentisTM(雷珠單抗)，CyramzaTM(Ramucirumab)和JNJ-61610588。
22.如權利要求21所述的生物分子的偶聯物，其中：
IL2中的突變位置選自：Lys32，Lys35，Thr37，Met39，Thr41，Lys43，Tyr45，Lys48，Lys49，Lys64，Leu72，Ala73，Ser75，Lys76，Leu94，Thr101，Thr102，Tyr107，Ala108，Thr111，Ala112，Leu12，His16，Leu19，Met23，Gly27，Ser75，Arg81，Leu85，Ser87和Asn88；
IL10中的突變位置選自：Thr6，Ser8，Ser11，Thr13，Gly17，Arg24，Ser31，Arg32，Lys34，Thr35，Lys40，Leu46，Lys49，Ser51，Lys57，Gly58，Ser66，Tyr72，Lys88，His90，Ser93，Lys99，Thr100，Arg104，Lys117，Ser118，Lys119，Lys125，Lys130，Lys134，Gly135，Tyr137，Tyr149，Thr155，Lys157和Arg159；
抗PD-1抗體Pembrolizumab的重鏈中的突變位置選自：Ser7，Gly8，Gly15，Ala16，Ser17，Ala24，Ser25，Gly26，Tyr27，Thr28，Thr30，Asn31，Tyr32，Tyr33，Tyr35，Ala40，Gly42，Gly44，Leu45，Gly49，Gly50，Ile51，Asn52，Ser54，Asn55，Gly56，Gly57，Thr58，Asn59，Lys63，Lys65，Thr69，Leu70，Thr71，Thr72，Asp73，Ser74，Ser75，Thr76，Thr77，Thr78，Ala79，Leu83，Ser85，Leu86，Thr91，Ala92，Arg99，Asp100，Tyr101，Arg102，Asp104，Gly106，Gly111，Gly113，Thr114，115Thr，117Thr，Ser119，Ser120，Ala121，Ser122，Thr123，Lys124，Gly125和Ser127；輕鏈中的突變位置選自：Ile2，Thr5，Ser7，Ala9，Thr10，Leu11，Ser12，Leu13，Ser14，Gly16，Ala19，Thr20，Ala25，Ser26，Lys27，Gly28，Ser30，Thr31，Ser32，Gly33，Tyr34，Ser35，Tyr36，Leu37，Gly45，Ala47，Leu50，Leu51，Ile52，Tyr53，Leu54，Ala55，Ser56，Tyr57，Leu58，Ser60，Gly61，Ala64，Ser67，Gly68，Ser69，Gly70，Ser71，Gly72，Thr73，Ala76，Thr78，Ser80，Ser81，Ser95，Arg96，Asp97，Leu98，Leu100，Thr101，Phe102，Gly104，Ile110，Lys111和K130；
抗PD-1抗體Nivolumab的重鏈中的突變位置選自：Gln3，Ser7，Gly8，Gly9，Gly10，Gly15，Ser17，Lys23，Ala24，Ser25，Gly26，Ile27，Asn31，Thr28，Ser30，Ser32，Gly33，Ala40，Gly42，Gly44，Leu45，Ala49，Ile51，Tyr53，Asp54，Gly55，Ser56，Lys57，Tyr59，Tyr60，Ala61，Asp62，Ser63，Lys65，Gly66，Thr69，Ile70，Ser71，Arg72，Asp73，Asn74，Ser75，Lys76，Asn77，Thr78，Leu79，Leu81，Ser85，Leu86，Ala88，Thr91，Ala92，Thr98，Asn99，Asp100，Asp101，Tyr102，Gly104，Gly106，Thr107，Leu108，Thr110，Ser112，Ser113，Ala114，Ser115，Thr116，Lys117，Gly118和Ser120；輕鏈中的突變位置選自：Ile2，Leu4，Thr5，Ser7，Ala9，Thr10，Leu11，Ser12，Leu13，Ser14，Gly16，Ala19，Thr20，Leu21，Ala25，Ser26，Ser28，Ser30，Ser31，Tyr32，Leu33，Ala34，Tyr36，Gly41，Ala43，Leu46，Leu47，Ile48，Tyr49，Asp50，Ala51，Ser52，Asn53，Arg54，Ala55，Thr56，Gly57，Ile58，A...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉源，王海洋，李仁柯，張蕊，劉辰，
申請(專利權)人：亞飛上海生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31
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