一種利用適配子快速檢測水產品中孔雀石綠的方法技術

本發明專利技術公開了一種利用適配子快速檢測水產品中孔雀石綠的方法，將待測樣品與孔雀石綠適配子和帶有檢測標記物的報告序列混合，報告序列與待測樣品中的孔雀石綠可競爭性地與孔雀石綠適配子結合后，檢測報告序列上的標記物，計算待測樣品中孔雀石綠含量。根據本發明專利技術方法研制的試劑盒與快速檢測試紙，能較好滿足目前對水產品孔雀石綠殘留檢測的迫切需要，用于海關檢測，食品衛生部門檢測，易于大范圍推廣應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及食品檢測領域，尤其涉及一種水產品中孔雀石綠的檢測方法。
技術介紹
孔雀石綠(Malachite green,簡稱MG),屬三苯曱烷類染料，其代謝 物為無色孔雀石綠(Leucomalachite green, LMG),長期以來，由于孔雀 石綠在水產養殖中具有良好的抗真菌病，水產品保鮮以及價格低廉等優 點，因此，成為許多養殖戶青睞的"漁藥"來使用，但這兩種物質所均具 有高毒素、高殘留和高致畸、致突變等副作用，不僅給我國水產品的出口 帶來了巨大障礙，而更為重要的是，給人們的健康構成了潛在威脅。鑒于孔雀石綠及其代謝物的危害性，許多國家都將其列為水產養殖禁 用藥物，我國也于2002年5月將其列為《食品動物禁用的獸藥及其化合 物清單》中，然而，由于水產養殖戶健康養殖的意識淡薄，以及水產品安 全管理機制的不完善等原因，僅2005年，就在國內許多地方(尤其是福 建、江西和浙江)的多種水產品(如鰻魚、甲魚等)中檢測出孔雀石綠 的高殘留。目前，關于孔雀石綠及其代謝物的檢測方法主要有三種，但這些方法 均存在著一定局限性(l)高效液相色譜法，當含量較低時，利用保留時 間很難定性；(2)氣質聯用法，只能用來對無色孔雀石綠的進行定性；(3) 液質聯用法(LC/MS ),效果較好，但價格昂貴；因此，孔雀石綠及其代 謝物在水產動物中快速、穩定可靠殘留檢測方法的建立成為國內外亟待解 決的技術難題。但孔雀石綠具有很強的免疫毒性，制備孔雀石綠特異性抗體是一個非常困 難的工作，而且制備一種抗體周期也比較長， 一般需要6個月以上。因此瓶頸問題。寡核苷酸適配子技術是近年來發展的一種新型的分子印跡技術，是釆用SELEX技術體外篩選獲得的。SELEX技術由Tuerk和Gold等在90年 代初建立的，通過多輪的選擇和擴增過程(PCR或RT-PCR)從隨機寡核 苷酸文庫中篩選特異識別靶物質的寡核苷酸適配子的組合化學技術，是一 種研究核酸結構與功能的有效方法。SELEX技術自創立以來得到迅猛發 展，目前因其具有庫容量大、篩選的適配子的靶分子范圍廣、親和力高與 特異性強等優點已在生命科學基礎研究、疾病治療、藥物篩選和臨床診斷 等領域得到了廣泛的探索和運用。中國專利技術專利申請200510060995.1中公開了 一種水產品中無色孔雀 石綠間接竟爭ELISA檢測試劑盒。試劑盒的檢測板為包被無色孔雀石綠 與白蛋白偶聯物的可拆96孔酶標板，抗無色孔雀石綠抗體為利用無色孔 雀石綠與白蛋白的偶聯物免疫小鼠而制備的單克隆抗體，檢測樣品先經過 勻質后用乙酸乙酯和環己烷進行提取，調節pH值后稀釋用于檢測。樣本 檢測的判定標準為以標樣濃度的對數值為橫坐標，抑制率為縱坐標的回 歸曲線。才艮據每個樣品的抑制率就可從曲線上讀出相對應樣品的濃度。該 方法檢測的靈敏度為0.0023嗎/ml,檢測范圍是0.0016-1 (ig/ml。但該技術中高效的單克隆抗體的獲得十分困難，也增加了成本。
技術實現思路
本專利技術提供一種操作方便，準確度高的水產品中孔雀石綠的快速檢測 方法。，將待測樣品與孔 雀石綠適配子和帶有檢測標記物的報告序列混合，報告序列與待測樣品中 的孔雀石綠可竟爭性地與孔雀石綠適配子結合后，檢測(用酶相對的顯色 底物檢測)4艮告序列上的標記物，計算待測樣品中孔雀石綠含量。所述的檢測標記物為辣根過氧化物酶、化學發光基團、化學熒光基團 或膠體金等。所述的報告序列的制備根據獲得的孔雀石綠適配子序列，設計合成 與適配子序列部分(5 ，端回文互補序列)互補的報告序列，將檢測標記物 標記在凈艮告序列上。所述的孔雀石綠適配子通過如下步驟制得(1)構建一個序列長度約為80個堿基的隨機ssDNA文庫，ssDNA 序列兩端帶有限制性內切酶位點的固定序列、中間為35個序列隨機的堿 基，根據ssDNA序列兩端的固定序列設計PCR引物；(2 )采用不對稱PCR法或生物素-鏈親和素磁珠法對步驟(1 )得到 的ssDNA文庫進行擴增；(3 )利用孔雀石綠-OVA偶聯物包被微孔板介質法或高效毛細管電泳 方法從擴增后的ssDNA文庫中進行SELEX篩選，得到與孔雀石綠特異結 合的ssDNA即孔雀石綠適配子。步驟(2)中所述的不對稱PCR法即在PCR擴增循環中引入不同濃 度的引物(一般釆用50: 1-100: l比例的引物濃度)，在最初10-15個循 環中主要產物為雙鏈DNA (dsDNA),但低濃度引物被耗盡后，高濃度引 物介導的PCR反應可產生大量的ssDNA。步驟(2)中所述的生物素-鏈親和素磁珠法即在PCR體系中，設計并 合成下游引物的5，端標記有生物素，以ssDNA文庫為模板，進行PCR 擴增可得到3，端帶有生物素的dsDNA產物，經分離純化后與鏈親和素 磁珠結合(dsDNA通過3，端的生物素與磁珠上的鏈親和素結合)，然后 用 一定濃度(O.15mol/L )的NaOH使dsDNA變性解鏈，帶有生物素的一條 鏈與鏈親和素結合留在磁珠上，而不帶生物素的一條鏈被解離出來，經分 離純化后用于下一輪篩選，重復上述操作循環富集(一般10次左右)直 至孔雀石綠和適配子的結合率達到90%。偶聯物(MG-OVA ) 96孔酶標板，同時設白蛋白(OVA)包被孔和空白對 照孔，均用3。/。的BSA封閉，PCR擴增與純化的ssDNA文庫先與空白對 照孔反篩去除與BSA結合的ssDNA，再與OVA包被孔初篩去除與OVA 結合的ssDNA,然后轉移至孔雀石綠-OVA偶聯物包被孔結合，經洗脫、 分離與純化得到與孔雀石綠特異結合的ssDNA。步驟(3)中所述的高效毛細管電泳方法即將一定量的PCR擴增、純 化的ssDNA文庫與孔雀石綠孵育后，通過高效毛細管電泳將未結合序列 與孔雀石綠結合復合物分離，收集結合序列，重復上述操作循環富集-分 離最后得到與孔雀石綠特異結合的ssDNA (即孔雀石綠適配子)。根據本專利技術所述的快速檢測方法，可以將相關試劑封裝或固定后制成 試劑盒或快速纟全測試紙。本專利技術還提供了用于檢測水產品中孔雀石綠的試劑盒，至少包括包被有孔雀石綠適配子的測試片基(如96孔酶標板或硝酸纖維膜等)，還包括 結合緩沖液，包被緩沖液。將孔雀石綠適配子包被于測試片基上時，可將連接序列(如3， -ACTCATCTGTGA-5' ) 5，端與孔雀石綠適配子序列3，端連接合成孔雀 石綠適配子-連接序列；設計合成與連接序列互補的固定序列(如 3'-ATGAGTAGACACT-5，)，將固定化基團(如將親和素固定在NC膜的 表面，再通過親和素將帶有生物素的單連Biotin—ssDNA固定)標記在固 定序列的3，端，通過固定化基團與連接序列將孔雀石綠適配子包被于測試 片基上。本專利技術采用 一種不依賴實驗動物的適配子(aptamer)技術，通過指數 級冨集酉己體的系統進4匕4支術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX )體外篩選到高親和性特異識別孔雀石綠的適配子， 替代傳統免疫學方法中的抗體來建立一種快速^^測孔雀石綠方法。本專利技術4企測方法優點為1. 篩選周期短3周；2. 與孔雀石綠結合的特異性強，靈敏度高；3. 適配子的合成周期短，利于大規模本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利用適配子快速檢測水產品中孔雀石綠的方法，將待測樣品與孔雀石綠適配子和帶有檢測標記物的報告序列混合，報告序列與待測樣品中的孔雀石綠可競爭性地與孔雀石綠適配子結合后，檢測報告序列上的標記物，計算待測樣品中孔雀石綠含量；　所述的檢測標記物為辣根過氧化物酶、化學發光基團、化學熒光基團或膠體金等；　所述的報告序列與孔雀石綠適配子序列部分互補。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張明洲，劉軍，胡華軍，王墨染，方靈，黃軍，
申請(專利權)人：中國計量學院，杭州寶派生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：86[中國|杭州]