本發明專利技術涉及重組多肽，特別是結合纖連蛋白的Ｅｄ－Ｂ－同種型并可阻斷其功能的抗體或抗體片段。另外，本發明專利技術還揭示了本發明專利技術的多肽的診斷和藥物學應用。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】功能阻斷性抗-ED-B-纖連蛋白抗體的鑒別與鑒定專利技術描述本專利技術要求2005年7月ll日提交的US臨時申請60/697，565的申請日，所 述文獻包含在此作為申請。本專利技術涉及重組多肽，特別是結合纖連蛋白的ED-B-同種型并可阻斷其功 能的抗體或抗體片段。另外，本專利技術揭示了所述多肽的診斷和藥物學應用。在腫瘤發生和進展期間，其中生長有腫瘤的胞外基質(ECM)通過已經存在 的ECM的蛋白酶解降解而被修飾。這個過程產生腫瘤誘導的基質，其與正常 組織中存在的ECM不同。腫瘤誘導的ECM看起來是腫瘤生長和腫瘤血管發生 的最佳環境(l-4)。在腫瘤血管發生中，新血管從現有的血管中形成。這個過程需要ECM的 蛋白酶解，新血管結構中內皮細胞的靶向生長和分化，這是為腫瘤進一步生 長所必需的(5)。纖連蛋白是基質糖蛋白的一個重要類別。其主要作用包括促進細胞與眾 多不同的胞外基質粘附。纖連蛋白在培養的未轉化細胞表面上的存在以及其 在轉化細胞上的不存在的事實使得可以鑒別纖連蛋白為重要的粘附蛋白。其 與眾多不同分子例如膠原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和纖維蛋白相互作用，并 因此調節細胞形態及細胞骨架的產生。另外，其與胚胎發生期間的細胞遷移 和細胞分化相關。再者，其對于創傷愈合很重要，其使得巨噬細胞及其它免 疫細胞可以在所述的區域內遷移，并且通過使得血小板可以與血管損傷區域 粘附而形成血凝塊。纖連蛋白是兩個相似肽的二聚體，從而每個鏈的長度均為大約60-70nm。 目前已經鑒別了至少20條不同的纖連蛋白鏈，其均是通過對單一纖連蛋白基因的RNA轉錄體進行可變剪接而產生的。纖連蛋白是高分子量且調節粘附的糖蛋白，在脈管系統中發揮重要作用。 另外，纖連蛋白在血管發生期間對于內皮細胞具有趨化作用，調節生長因子 的功能并支持內皮細胞的線性生長(6-9)。對纖連蛋白的蛋白酶解產物進行的 分析示出所述多肽由6個重度折疊的結構域(heavily folded domains)組成，每個 結構域均含有所謂的重復序列("重復")，其氨基酸序列的相似性使得可以將 其分為3個類型(1、 n和m型)。所述二聚體兩個鏈的中心區域由所謂的III型重 復節段組成，平均長度為90個氨基酸(10)。結構研究表明每個III型重復均由7 個P鏈組成，其折疊成2個反平行的折疊層，較短的環形區域暴露作為潛在的 蛋白質-蛋白質相互作用的位點(ll)。這些m型重復使得纖連蛋白可以作為粘附分子，與稱作"整聯蛋白"的細胞表面分子相互作用。術語"整聯蛋白"在1987年首次使用(12)，用于描述 在胞外基質與胞內細胞骨架之間作為介質并因此誘導細胞粘附和遷移的一組 相關的異源二聚體細胞表面分子。這些異源二聚體受體"整合"或介導來自 胞外環境的具有特異性細胞功能的信號。到目前為止，已知可以與20種以上a 亞單位特異性且非共價相互作用的17種p亞單位，特別是形成20個不同家族 (13)。在m型纖連蛋白第10個重復(m-10)中發現的序列RGDS特別介導纖連蛋 白與至少8種不同整聯蛋白的相互作用。此外，已經示出至少4種整聯蛋白可 以RGDS-非依賴性途徑與纖連蛋白特異性相互作用(13)。除了III7-、 1118-、 III9-和III10序列之外，m型的重復序列還包含EIIIB和EmA (ED-B和ED-A)重復。ED-B-纖連蛋白在成人的正常組織中不能檢測到(唯一的例外是繁殖期子 宮內膜)，但是除了ED-B在間質局部表達之外，其在胎兒組織和腫瘤生長中強 烈表達。此外，ED-B-纖連蛋白局部定位于血管周圍，在血管發生期間新形成。 為此，ED-B-纖連蛋白是(腫瘤)血管發生過程的一種特異性標記蛋白(14)。ED-B結構域是高度保守的完全的m型同源成分，由91個氨基酸組成。人與大鼠之間的同源程度為100%，人與雞之間的同源程度為96%。在文獻中， 對于ED-B結構域的功能所知甚少。有幾個出版物(15-17)推測其對于不同細胞 的一般粘附介導作用。迄今為止仍未揭示對于內皮細胞的特異功能。在WO 02/20563中，揭示了重組ED-B示出在體外的特異性促血管發生作 用(i) bFGF-刺激的人皮膚微血管內皮細胞(HDMVEc)的增殖由重組ED-B增 強，(ii)所述蛋白質介導HDMVEC的粘附，及(m)重組ED-B刺激膠原凝膠中 HDMVEc的侵潤和分化(管形成)。另外，這些ED-B介導的作用可以被衍生自ED-B結構域的合成肽特異性阻 斷。因此所述肽序列代表內皮細胞表面上ED-B特異性受體的結合區，利用 a^-整聯蛋白的親和層析方法鑒別。0C2pr整聯蛋白與ED-B結構域之間的特異 性相互作用在先前的文獻中未描述。在WO 02/20563中還揭示了由ED-B-纖連蛋白結構域特異性調節的蛋白 質，其包含0C2Pp整聯蛋白、局部粘附激酶和CD6配體(ALCAM)、玻連蛋白受 體的a鏈、整合的oc-8亞單位或者卵泡抑素相關蛋白的前體。具有部分重疊性質的許多整聯蛋白受體由內皮細胞表達(lit.: D.G.Stupack andD.A.Cheresh, SciSTKE， 2002Feb 12; 2002)。這些表達方式示出不同的整聯 蛋白(例如avP3和oc5pl)介導相似的生物學現象(粘附、遷移和存活)，并因此代 表內皮細胞的維護其行為和存活的冗余系統。先前已知a2pi與其天然配體膠 原相互作用。這種相互作用的阻斷可導致抗血管發生作用(Y.Funahashi et al.Cancer Res.62: 6116-6123, 2002)。本專利技術的一個目的因此是制備功能阻斷性結合分子，例如特異性阻斷 ED-B結構域的受體結合位點的抗體。這些結合分子對于(腫瘤)內皮細胞具有 抗血管發生作用。與相對廣泛表達的(X2Pr整聯蛋白相反，所述ED-B結構域代 表這種結合分子的理想及特異性的靶分子。ED-B的結構難以產生單克隆和多克隆抗體，因此認為ED-B在體內免疫原性較低。抗體BC-1 (J.Cell Biol.108 (1989), 1139-1148)與纖連蛋白的隱蔽表位 反應，其僅當存在ED-B時存在，因此不直接與ED-B反應。抗體L19 (Tarli et al.Blood 94 (1999)， 192-198及WO 01/62800)是利用重組ED-B作為免疫原產生 的，其無生物學活性，即其不能在有效程度識別細胞粘附ED-B。令人驚奇地，現在發現可以產生功能阻斷性ED-B結合分子，例如阻斷 ED-B功能的抗體MOR03255，其極大程度抑制細胞粘附ED-B，且使得體內腫 瘤生長顯著降低。本專利技術的結合分子產生的ED-B阻斷顯然不能代償膠原-整聯 蛋白的代償機制。利用HuCAI^-GOLD抗體文庫-具有例如1.6 x 10E10個Fab片段形式的不 同抗體的抗體文庫，從HuCAL-共有序列(WO97/08320;Knappik，A.; Ge,L.; Honegger, A.; Pack, P.; Fischer, M.; Wellnhofer, G.; Hoess， A.; Wolle, J.; Plunckthun, A.and Virnekas, B.(2000) J.Mol.Biol.296:57-86)中本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種多肽，其特征在于： （ｉ）其特異性結合纖連蛋白的ＥＤ－Ｂ結構域； （ｉｉ）其抑制ＥＤ－Ｂ結構域與其受體之間的相互作用。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
【專利技術屬性】
技術研發人員：A門拉德，J普拉斯勒，A魏德曼，
申請(專利權)人：拜耳先靈醫藥股份有限公司，莫弗西斯股份公司，
類型：發明
國別省市：DE[德國]
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