蛋白質結晶條件的篩選方法技術

一種蛋白質結晶條件的篩選方法，其特征在于包括下述步驟：（ａ）用緩沖液溶解蛋白質，使蛋白質的終濃度達到５～５０ｍｇ／ｍｌ，用０．２２μｍ的濾膜過濾除去雜質；（ｂ）用不同的結晶緩沖液來篩選蛋白質的結晶條件；（ｃ）蛋白質晶體的形核和生長，在密 閉的可設定變溫程序的控溫箱中進行，預先設定該密閉環境的溫度，控溫箱從１～４℃開始線性升溫，８～３３６小時后升溫至３０～６０℃，然后從３０～６０℃線性降溫，８～３３６小時后降至１～４℃，完成一個循環周期；或者設定控溫箱從３０～６０℃線性降溫，８～３３６小時后降至１～４℃，再從１～４℃開始線性升溫，８～３３６小時后升溫至３０～６０℃，完成一個循環周期；（ｄ）上述結晶體系在密閉溫控箱中完成一個溫度循環周期后取出，在顯微鏡下統計出蛋白質晶體的條件數目。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種，特別是通過溫度掃描對蛋白質結晶條件進 行篩選的方法。
技術介紹
結構生物學是分子生物學的前沿和主流，對蛋白質結構與功能的研究已經成為揭示基因 組功能的重要途徑。獲取高質量及合適尺寸的蛋白質晶體是完成結構解析的瓶頸，而結晶條 件的篩選是獲得高質量蛋白質晶體的第一步，也是最關鍵的一步。影響蛋白質結晶條件篩選的因素是多方面的，其中溫度可通過改變蛋白質的溶解性，進 而影響蛋白質在溶液中的過飽和度，而成為影響蛋白質結晶的一個重要因素。但一直以來， 人們很少在實踐中運用此特點開發蛋白質結晶條件篩選技術。通常的蛋白質結晶條件篩選是在某個特定溫度下進行的。文獻"Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. 1991， Vol. 24: 409-41 l"公開了 一種蛋白質結晶條 件的篩選方法，選擇Hampton公司貨號為HR2-110的Crystal Screen試劑盒構建結晶溶液體 系。蛋白質晶體在恒溫4'C和室溫下生長，統計蛋白質在50種結晶緩沖液中出現晶體的成功 率。實驗結果得出溶菌酶結晶成功率為10%,胰島素結晶成功率為4%，過氧化氫酶結晶成 功率為10%，核糖核酸酶A結晶成功率為8。/。，胃蛋白酶結晶成功率為6%。由于對不同蛋白 質而言，最適合結晶的溫度可能有所不同，因此在某個特定的溫度下進行篩選時，適宜在其 它溫度條件下結晶的緩沖液就不能產生晶體。如此將使這部分實際可以出現晶體的溶液條件 被標記為不能結晶的溶液，從而降低篩選的成功率。為了提高蛋白質結晶條件篩選的成功率， 應盡可能在所有可能結晶的溫度條件下進行篩選。但這樣的篩選策略在實踐中由于工作量及 樣品消耗量極大，實現困難。
技術實現思路
為了克服現有蛋白質結晶條件篩選技術中，因篩選溫度覆蓋不全而導致不能發現全部結 晶條件的不足，本專利技術提供了一種新的。該方法通過溫度掃描， 可覆蓋篩選過程中可能結晶的每一個溫度點，以此提高蛋白質結晶篩選的成功率。本專利技術解決其技術問題的技術方案是， 一種，其特征在于包括以下步驟(a)用緩沖液溶解蛋白質，使蛋白質的終濃度達到5 50mg/ml，用0.22 pm的濾膜過濾 除去雜質；(b) 用不同的結晶緩沖液來篩選蛋白質的結晶條件；(c) 蛋白質晶體的形核和生長，在密閉的可設定變溫程序的控溫箱中進行，預先設定該 密閉環境的溫度，控溫箱從1 4-C開始線性升溫，8 336小時后升溫至30 60°C，然后從 30 60'C線性降溫，8 336小時后降至1 4°C，完成一個循環周期；或者設定控溫箱從30 60'C線性降溫，8 336小時后降至1 4°C，再從1 4'C開始線性升溫，8 336小時后升溫 至30 60'C，完成一個循環周期；(d) 上述結晶體系在密閉溫控箱中完成一個溫度循環周期后取出，在顯微鏡下統計出蛋 白質晶體的條件數目。本專利技術的有益效果是由于采用了溫度掃描方式，可以通過一次實驗覆蓋適宜于蛋白質 結晶的所有可能溫度，而不用在所有可能結晶的溫度點下一一建立實驗組進行篩選，從而提 高實驗效率，并節約結晶緩沖液和蛋白質樣品。通過本專利技術，可使蛋白質結晶條件篩選成功 率由過去的4 10%提高至14 50%。下面結合實施例對本專利技術作詳細說明。具體實施例方式實施例l:溶菌酶結晶條件的篩選。第一步將經過六次重結晶的日本Seikagaku公司的貨號為100940的溶菌酶，溶于pH 為4.60， 0.1 mol/L的醋酸鈉緩沖液中，使其終濃度為20 mg/ml，用0.22 pm的濾膜濾去雜質。第二步本實施例用Hampton公司貨號為HR2-110的Crystal Screen試劑盒的50種結晶 緩沖液對溶菌酶結晶條件進行篩選。第三步將整個結晶體系放置于可進行程序溫度控制的溫控箱中，其溫控熱源為可編程 的高低溫循環水浴，型號為PolyScience 9712AA2Y。具體溫控程序為從rC線性升溫168小時至60°c，然后再以同樣變溫速率從6(Tc降溫至rc，即一個溫控周期為 ix^^6ot:，^i"c。或者從60t:線性降溫i68小時至it:，然后再以同樣變溫速率從i°c線性升溫至60°C。第四步樣品在溫控箱中放置一個溫度循環周期后，在顯微鏡下觀察統計出溶菌酶晶體 的條件數目，并計算結晶篩選的成功率。經過統計得到如下結果有21種結晶條件出現了溶菌酶晶體，結晶成功率為42%。與現 有技術在4'C和室溫篩選結晶條件的結果相比，成功率提高了 4.2倍。實施例2:胰島素結晶條件的篩選。第一步將美國Sigma公司貨號為15500的胰島素，溶于1 mol/L的氨水中，使其終濃度 為30 mg/ml，用0.22 pm的濾膜濾去雜質。第二步本實施例用Hampton公司貨號為HR2-110的Crystal Screen試劑盒的50種結晶緩沖液對胰島素的結晶條件進行篩選。第三步將整個結晶體系放置于可進行程序溫度控制的溫控箱中，其溫控熱源為可編程 的高低溫循環水浴，型號為PolyScience 9712AA2Y。具體溫控程序為從2'C線性升溫24小 時至35°C，然后再以同樣變溫速率從35'C降溫至2°C,即一個溫控周期為 2'c"^^35'c2"^"l2"C。或者從35-C線性降溫24小時至2'C，再以同樣變溫速率從2'C線性 升溫至35'C。第四步樣品在溫控箱中放置一個溫度循環周期后，在顯微鏡下觀察統計出胰島素晶體 的條件數目，并計算結晶篩選的成功率。經過統計得到如下結果有25種結晶條件出現了胰島素酶晶體，結晶成功率為50%。與 現有技術在4'C和室溫篩選結晶條件的結果相比，成功率提高了 12.5倍。實施例3:過氧化氫酶結晶條件的篩選。第一步將美國Sigma公司貨號為C0615的過氧化氫酶，溶于pH為7.00， 0.025 mol/L HEPES-Na緩沖液中，使其終濃度為40 mg/ml，用0.22 pm的濾膜濾去雜質。第二步本實施例用Hampton公司貨號為HR2-110的Crystal Screen試劑盒的50種結晶 緩沖液對過氧化氫酶的結晶條件進行篩選。第三步將整個結晶體系放置于可進行程序溫度控制的溫控箱中，其溫控熱源為可編程 的高低溫循環水浴，型號為PolyScience 9712AA2Y。具體溫控程序為從4"C線性升溫8小 時至30'C，然后再以同樣變溫速率從3(TC降溫至4'C。或者從3(TC線性降溫8小時至4"C， 然后再以同樣變溫速率從4'C線性升溫至30°C 。第四步樣品在溫控箱中放置一個溫度循環周期后，在顯微鏡下觀察統計出過氧化氫酶 晶體的條件數目，并計算結晶篩選的成功率。經過統計得到如下結果有13種結晶條件出現了過氧化氫酶晶體，結晶成功率為26%。 與現有技術在4。C和室溫篩選結晶條件的結果相比，成功率提高了 2.6倍。實施例4:核糖核酸酶A結晶條件的篩選。第一步將美國Sigma公司貨號為R5500的核糖核酸酶A，溶于pH為7.00， 0.025 mol/L HEPES-Na緩沖液中，使其終濃度為5 mg/ml，用0.22 ^un的濾膜濾去雜質。第二步本實施例用Hampton公司貨號為HR2-1本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種蛋白質結晶條件的篩選方法，其特征在于包括下述步驟：（ａ）用緩沖液溶解蛋白質，使蛋白質的終濃度達到５～５０ｍｇ／ｍｌ，用０．２２μｍ的濾膜過濾除去雜質；（ｂ）用不同的結晶緩沖液來篩選蛋白質的結晶條件；（ｃ）蛋白質晶體的形核和生長，在密閉的可設定變溫程序的控溫箱中進行，預先設定該密閉環境的溫度，控溫箱從１～４℃開始線性升溫，８～３３６小時后升溫至３０～６０℃，然后從３０～６０℃線性降溫，８～３３６小時后降至１～４℃，完成一個循環周期；或者設定控溫箱從３０～６０℃線性降溫，８～３３６小時后降至１～４℃，再從１～４℃開始線性升溫，８～３３６小時后升溫至３０～６０℃，完成一個循環周期；（ｄ）上述結晶體系在密閉溫控箱中完成一個溫度循環周期后取出，在顯微鏡下統計出蛋白質晶體的條件數目。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：尹大川，張辰艷，鹿芹芹，郭云珠，郭衛紅，王璽凱，李海生，盧慧甍，葉雅靜，
申請(專利權)人：西北工業大學，
類型：發明
國別省市：87