改進的免疫測定方法技術

本發明專利技術涉及檢測哺乳動物受試者中疾病狀態或疾病易感性的方法，包括檢測包含所述哺乳動物受試者體液的測試樣品中的抗體，其中所述抗體是疾病狀態或疾病易感性的生物標志物，該方法包括：（ａ）使所述測試樣品接觸多種不同量的所述抗體特異性抗原，（ｂ）檢測所述抗體與所述抗原之間特異性結合的量，（ｃ）對步驟（ａ）中所用的每個抗原量，繪制或計算所述特異性結合量對抗原量的曲線，以及（ｄ）基于每個所用的不同抗原濃度下所述抗體與所述抗原之間的特異性結合量，確定該疾病狀態或疾病易感性是否存在。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術一般涉及診斷或預后測定領域，特別涉及優化用于在包含 患者體液的樣品中檢測抗體的測定，其中這樣的抗體用作疾病狀態或疾病易感性的生物標志物。
技術介紹
許多診斷、預后和/或監測測定依賴于檢測特定疾病狀態或疾病易感性的生物標志物。這樣的生物標志物一fcl:作為特定疾病特征的或 與疾病易感性相關的蛋白質或多肽。抗體特別是自身抗體也能作為疾病或疾病易感性的生物標志物， 這一點在近年來開始愈專利技術顯。自身抗體是天然存在的抗體，其針對 被個體免疫系統識別為外源的抗原，盡管該抗原實際上源自該個體。 它們可以作為循環的游離自身抗體存在于循環中，或者以由與其靶標 志物蛋白結合的自身抗體組成的循環免疫復合物的形式存在。在一些 情況下，正常細胞表達的野生型蛋白質與由疾病細胞產生或在疾病過 程中產生的該蛋白質的改變形式之間的差異可能導致個體的免疫系統 將所述改變的蛋白質識別為"非自身"，并因而在該個體中引發免疫應 答。這可以是體液(即B細胞介導的)免疫應答，其引起產生對該改 變的蛋白質具有免疫特異性的自身抗體。W099/58978描述了用于檢測/診斷癌癥的方法，該方法基于評估 個體對兩種或更多不同腫瘤標志物的免疫應答。這些方法通常包括使采自個體的體液樣品接觸具有兩種或更多不同肺瘤標志物抗原的板， 每種抗原來自 一種單獨的腫瘤標志物蛋白，并且檢測該腫瘤標志物抗 原與對該腫瘤標志物蛋白具有免疫特異性的循環自身抗體結合的復合物的形成。將存在這樣的循環自身抗體作為存在癌癥的指示。測量個體在自身抗體產生方面對存在腫瘤標志物蛋白的免疫應答 的測定提供了直接測量或檢測體液中腫瘤標志物蛋白的替代方案。這 樣的測定實質上構成了對腫瘤標志物蛋白存在情況的間接檢測。由于 免疫應答的性質，4艮可能極少量的循環腫瘤標志物蛋白即可引發自身 抗體，因此依賴于檢測對腫瘤標志物的免疫應答的間接方法將比直接 測量體液中腫瘤標志物的方法更靈敏。因此，基于檢測自身抗體的測 定可能在疾病過程的早期特別具有價值，并且可能在無癥狀患者的篩 選方面也是如此，例如進行篩選以在無癥狀個體的群體中鑒定具有發 生疾病"風險"的個體、在無癥狀個體的群體中鑒定已發生疾病的個 體。另外，基于檢測自身抗體的方法可能在疾病過程的早期特別具有 價值，并且也可能被用于在無癥狀群體中鑒定已發生疾病的個體。此 外，它們還可能用于復發性疾病的早期檢測。該測定方法在選擇或監 測疾病的治療方案方面也具有價值。抗體和自身抗體也可作為其他疾病狀態或疾病易感性的生物學標志物，例如類風濕性關節炎、系統性紅斑狼疾(SLE)、原發性膽汁性 肝硬化(PBC)、自身免疫性甲狀腺炎(例如橋本甲狀腺炎))、自身免 疫性胃炎(例如惡性貧血)、自身免疫性腎上腺炎(例如艾迪生病)、 自身免疫性甲狀旁腺功能減退、自身免疫性糖尿病(例如I型糖尿病)、 重癥肌無力等。本專利技術人認識到，當基于抗體檢測的測定在診斷或預后上用于評 價群體中個體的疾病狀態、疾病進程或疾病易感性時，會在設計適用于整個待篩選^的標準化測定法方面遇到困難，因為個體之間抗體 的絕對量存在顯著的變化。這會使假陰性結果的發生率很高，例如在 抗體量低的個體中。類似地，對真陽性結果的評分也存在困難，因為 個體間抗體絕對量的變化意p未著難以為陽性測定結果"^殳定適合于篩選 群體中所有個體的閾值。本專利技術人現在確定，可以通過包括抗原滴定步驟來顯著改善基于 檢測作為疾病生物標志物的抗體特別是自身抗體的測定方法的性能、 更具體地為臨床效用以及可靠性。通過對懷疑含有抗體的樣本針對一 系列不同的抗原量進行測試并創建滴定曲線，有可能獨立于樣品中存 在的抗體絕對量而可靠鑒定真陽性篩選結果。這樣的方法與現有技術 中的方法相反，在這些現有技術的方法中，滴定抗原僅用于創建校準 曲線，以鑒定最適用于在實際患者樣品中檢測抗體的抗原濃度。在這 些方法中，僅將單點測量用于實際診斷。因此，這些方法不容許個體 間檢測的抗體量的變化，導致發生所說的假陽性和假陰性。本專利技術人 已經發現，本專利技術的抗原滴定法的特異性和靈敏度高于在單個抗原濃 度下測定自身抗體的反應性以及滴定血清樣品而不是抗原的方法。專利技術概述本專利技術的第一個方面提供在哺乳動物受試者中檢測疾病狀態或疾 病易感性的方法，其包括在包含來自該哺乳動物受試者的體液的測試 樣品中檢測抗體，其中所述抗體是疾病狀態或疾病易感性的生物標志物，該方法包括(a) 使所述測試樣品與多個不同量的所述抗體特異性的抗原接觸，(b) 檢測所述抗體與所述抗原之間特異性結合的量，(c) 對步驟(a)中所用的每個抗原量，繪制或計算該特異性結合量 對該抗原量的曲線，以及(d) 基于每個所用的不同抗原濃度下該抗體與該抗原之間特異性結 合的量，確定該疾病狀態或疾病易感性的存在與否。本專利技術的第二個方面提供在包含來自哺乳動物受試者的體液的測 試樣品中檢測抗體的方法，其中所述抗體針對51入該哺乳動物受試者 的外源物質，該方法包括(a)使所述測試樣品與多個不同量的所述抗體特異性的抗原接觸，(b) 檢測所述抗體與所述抗原之間特異性結合的量，以及(c) 對步驟(a)中所用的每個抗原量，繪制或計算該特異性結合量 對該抗原量的曲線。本專利技術的第三個方面提供在包含來自哺乳動物受試者的體液的測 試樣品中檢測抗體的方法，其中該抗體是疾病狀態或疾病易感性的生 物標志物，該方法包括(a) 使所述測試樣品與多個不同量的所述抗體特異性的抗原接觸，(b) 檢測所述抗體與所述抗原之間特異性結合的量，以及(c) 對步驟(a)中所用的每個抗原量，繪制或計算該特異性結合量 對該抗原量的曲線。在本專利技術的所有方面中，所述哺乳動物受試者優選為人。在本專利技術的所有方面中，該方法優選在體外在包含從該哺乳動物 受試者獲得或制備的體液的測試樣品上進行。在所有方面中，本專利技術的一個特別特征是，對測試樣品中是否存合的量(換言之，集合值)，而不是僅僅在單個濃度下的讀數。因此， 可以直接基于這些集合值確定患者樣品中是否存在疾病狀態或疾病易 感性或針對外源物質的抗體。優選地，基于以特異性結合量對抗原量 作圖時呈現的總體為S形或反S型的曲線作出該判斷。從本文實施例 中顯而易見地，本專利技術人觀察到本專利技術的抗原滴定法與基于單個讀數 的診斷或檢測方法相比具有更高的特異性和靈敏度，并且減少了假陽 性和假陰性鑒定的發生率。附圖說明圖1:使用抗原滴定曲線測量血清中的自身抗體。癌癥患者血清 17766 (C)與測試抗原強烈結合，具有特征性反S型曲線(-◆- )，但是不與陰性對照結合，VOL( + )。作為對比，來自正常個體的血 清18052 (N)不與測試抗原(^4^)或陰性對照(D結合。圖2:使用抗原滴定測定衡量的正常個體與原發性乳腺癌(PBC) 患者中p53自身抗體水平的比較。自身抗體水平表示為由于結合測試 抗原(p53)產生的OD65。減去由于結合陰性對照產生的OD65Q。正常 截止值(-一)計算為正常群體的平均值加2倍標準差。圖3顯示使用抗原滴定測定衡量的正常個體與肺癌患者中p53和 NY-ESO自身抗體水平的比較。自身抗體水平表示為由于結合測試抗 原(p53或NY-ESO)產生的OD65()減去由于結合陰性對照產生的 OD65。。正常截止值(-一)計算為正本文檔來自技高網...

【技術保護點】
檢測哺乳動物受試者中疾病狀態或疾病易感性的方法，包括檢測包含所述哺乳動物受試者體液的測試樣品中的抗體，其中所述抗體為疾病狀態或疾病易感性的生物標志物，該方法包括：　　　　（ａ）使所述測試樣品接觸與多種不同量的所述抗體特異性抗原，　　　　（ｂ）檢測所述抗體與所述抗原之間特異性結合的量，　　　　（ｃ）對步驟（ａ）中所用的每個抗原量，繪制或計算該特異性結合量對該抗原量的曲線，以及　　　　（ｄ）基于所用的每個不同抗原濃度下該抗體與該抗原之間特異性結合的量，確定該疾病狀態或疾病易感性的存在與否。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：約翰福賽思魯塞爾羅伯特森，托尼巴爾內斯，安德烈亞默里，卡羅琳查普曼，
申請(專利權)人：昂西免疫有限公司，
類型：發明
國別省市：GB[英國]