膝溝藻毒素GTX2,3間接競爭ELISA檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種膝溝藻毒素ＧＴＸ２，３進(jìn)行檢測的間接競爭ＥＬＩＳＡ方法，該方法包括抗原預(yù)包被條的制備和膝溝藻毒素的檢測，本發(fā)明專利技術(shù)利用得到的可分泌抗ＧＴＸ２，３單克隆抗體的陽性細(xì)胞可大量制得抗膝溝藻毒素２，３的單克隆抗體，所建立的方法成本低廉，可快速、簡便、靈敏地測定樣品中ＧＴＸ２，３的含量。本發(fā)明專利技術(shù)可以大規(guī)模地對海洋魚貝類食品中殘留的麻痹性貝類毒素進(jìn)行快速、靈敏的檢測。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
,3間接競爭elisa檢測方法
本專利技術(shù)屬于生物
，特別涉及一種利用抗膝溝藻毒素GTX2,3的單 克隆抗體對膝溝藻毒素GTX2，3進(jìn)行檢測的間接競爭ELISA方法。
技術(shù)介紹
麻痹性貝毒是一種低分子量、高毒性的貝毒，生存于海洋微藻中，主要通 過對鈉離子通道的影響而抑制神經(jīng)的傳導(dǎo)，為神經(jīng)毒素的一種。膝溝藻毒素 (gonyautoxin， GTX)為麻痹性貝類毒素(Paralytic Shellfish Posoning， PSP) 家族中重要的成員之一，是一類含雙胍基的三環(huán)生物堿化合物，呈堿性，易溶 于水，在弱酸和低溫條件下比較穩(wěn)定。調(diào)査顯示我國南北海區(qū)均存在可產(chǎn)生麻 痹性貝毒的赤潮藻，且在多個樣點發(fā)現(xiàn)了多種貝類含有麻痹性貝毒素。曾檢測 出廣東大亞灣貝類養(yǎng)殖區(qū)麻痹性貝毒含量達(dá)117Mu/g，超過可食用閾值近30 倍。已有資料顯示，GTX2，3是我國南方沿海染毒貝類和有毒赤潮藻的麻痹性 貝毒的主要成分之一。GTX2的分子結(jié)構(gòu) GTX3的分子結(jié)構(gòu)目前麻痹性貝毒的檢測方法主要有(1)小白鼠生物法是將藻或貝等生物組織的萃取液注射進(jìn)小鼠腹腔，根據(jù)小鼠死亡時間，査對Sommer表，判斷毒性大小。該方法的特點是不需要昂貴的儀器，操作簡便，但耗時長、誤差大、重現(xiàn)性差，同時有違動物保護(hù) 條例，在西方國家已不主張使用。(2) 高效液相色譜分析(HPLC):其原理是樣品中的毒素在氧化劑的作 用下生成熒光性物質(zhì)，在熒光檢測器上檢測。目前使用較多的是柱后氧化法。 HPLC檢測法的特點是靈敏、準(zhǔn)確，能確定樣品中毒素的具體成分等，但是 該方法需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，專門的分析技術(shù)人員，且標(biāo)準(zhǔn)品價格昂貴，前 處理麻煩，不能同時檢測大量樣品，不適合現(xiàn)場及大規(guī)模的推廣應(yīng)用。(3) 細(xì)胞毒檢測技術(shù)根據(jù)麻痹性貝類毒素可以阻斷Na+內(nèi)流這一作用 機制，在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入Na+通道活化劑烏本苷，如果沒有麻痹性貝毒的 存在，細(xì)胞會因Na+內(nèi)流過多而腫脹死亡，而麻痹性貝毒可有效抑制這一過 程，從而實現(xiàn)對毒素的檢測。但此種方法需要特殊的裝置，難以普及。(4) 傳統(tǒng)化學(xué)分析法以Bates等(1975)提出的氧化/熒光技術(shù)應(yīng)用最廣。其步驟是在堿性條件下用H202氧化PSP，使其生成具有熒光的物質(zhì)，再測定其熒光值。熒光值越高，毒素的毒性越大。許多學(xué)者應(yīng)用近代化學(xué)技術(shù)對麻 痹性貝毒毒素做了進(jìn)一步的探索研究，已見報道的分離方法有薄層層析法、 離子交換柱層析法、電泳法等。這些方法靈敏度高，但很費時，而且不能分 離出含量低的組分，限制了它們在日常毒性檢測中的應(yīng)用。(5) 免疫學(xué)檢測技術(shù)目前較多應(yīng)用于麻痹性貝類毒素檢測的是酶聯(lián)免 疫吸附檢測法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, ELISA)和膠體金試 紙條檢測法，其檢測的原理是將PSP毒素與載體蛋白偶聯(lián)免疫動物，獲得針 對毒素的抗體，利用樣品中的毒素與標(biāo)準(zhǔn)毒素競爭結(jié)合抗體并以此對樣品中 的毒素進(jìn)行定性或定量分析。該法簡便、快速，可同時分析大批量樣品。目前國外已經(jīng)有商品化的PSP酶免疫學(xué)檢測試劑盒上市，但是價格昂貴， 檢測一個樣品的價格都是在200元以上，同時這些試劑盒都是利用抗石房蛤 毒素抗體所制備，而我國多發(fā)的PSP毒素是GTX，故并不適合在我國推廣使 用。
技術(shù)實現(xiàn)思路
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本專利技術(shù)的目的在于提供一種利 用抗GTX2,3單克隆抗體檢測GTX2,3的間接競爭ELISA方法，該方法可以大規(guī) 模地對海洋魚貝類食品中殘留的麻痹性貝類毒素進(jìn)行快速、靈敏的檢測，保障我國海產(chǎn)品食用安全及維護(hù)我國在相關(guān)國際貿(mào)易領(lǐng)域中的利益。本專利技術(shù)的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn) 一種膝溝藻毒素GTX2，3間接競爭 ELISA檢測方法，包括如下步驟分別將魚貝類樣品提取液和系列濃度的 GTX2，3標(biāo)準(zhǔn)液加入到抗原預(yù)包被條的微孔中；然后加入抗GTX2,3單克隆抗 體到每個微 L,混合后孵育；在每個微孔中依次加入生物素化羊抗鼠IgG多抗 和辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素，孵育；在每個微孔加入顯色液TMBG ，3'，5 ，5'-四甲基聯(lián)苯胺)底物工作液反應(yīng)后，再在每個微孔中加入終止液終止反應(yīng)； 用酶聯(lián)讀數(shù)儀測定每個微孔的OD(吸光度)值；對照標(biāo)準(zhǔn)液所得的曲線回歸方 程，計算出魚貝類樣品中實際的GTX2,3濃度。上述膝溝藻毒素GTX2，3間接競爭ELISA檢測方法，包括如下步驟(1 )分別將50pL處理好的魚貝類樣品提取液和50^L系列濃度的GTX2，3 標(biāo)準(zhǔn)液加入到抗原預(yù)包被條的微孔中；然后加入5(HiL用稀釋液1 : 800稀釋 的抗GTX2，3單克隆抗體到每個微孔，混合，37。C孵育0.5 0.75h;然后用洗 滌液洗滌各微孔3 5次；(2) 在每個微孔中加入100^1用稀釋液1 : 2000稀釋的生物素化羊抗鼠 IgG多抗，37。C孵育0.5 0.75h;然后用洗滌液洗滌各微孔3 5次；(3) 在每個微孔中加入100^1用稀釋液1 : 6000稀釋的辣根過氧化物酶 標(biāo)記親和素，37'C孵育0.5 0.75h;然后用洗滌液洗滌各微孔3 5次；(4) 在每個微孔加入100pL顯色液TMB (3 ,3'，5 ,5'-四甲基聯(lián)苯胺)底 物工作液，反應(yīng)15 20min;(5) 在每個微孔中加入50^iL 2M H2S04 (終止液)終止反應(yīng)，并振蕩混勻；(6) 用酶聯(lián)讀數(shù)儀測定在450nm波長下的OD(吸光度)值；(7) 將所得標(biāo)準(zhǔn)液和魚貝類樣品的吸光度值除以O(shè)標(biāo)準(zhǔn)((Hxg/L的標(biāo)準(zhǔn) 液)的吸光度值再乘以100%，以此標(biāo)準(zhǔn)液計算值為縱坐標(biāo)，GTX2，3濃度(ppb) 的對數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)每個樣品的B/B0值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出 對應(yīng)的GTX2,3濃度，再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，計算出魚貝類樣品中實際的 GTX2，3濃度。所述的稀釋液和洗滌液均為含0.05% (體積百分比)吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液。為了更好地實現(xiàn)本專利技術(shù)，所述魚貝類樣品提取液按下述方法預(yù)處理將均質(zhì)后的10g魚肉或貝肉加入10 20ml 0.1M的HC1，煮沸并攪拌5分鐘，4°C 3500g離心10分鐘，離心后用5N的鹽酸調(diào)節(jié)PH到4.0以下，取10(^1上清 液，用稀釋液1:10 (體積比)稀釋。所述的抗GTX2,3單克隆抗體按下述方法制備而成用甲醛法將GTX2,3 偶聯(lián)到血藍(lán)蛋白(KLH)上，混合弗式不完全佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫 小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出穩(wěn)定分泌抗GTX2,3單克隆抗體 (MAb-GTX2，3)的陽性細(xì)胞株并擴大培養(yǎng)，注射細(xì)胞進(jìn)小鼠體內(nèi)誘生腹水， 純化，獲得抗GTX2，3單克隆抗體。所述抗原預(yù)包被條是按下述方法制備而成(a) 包被用pH9.6的0.05M碳酸鈉緩沖液或0.01 0.05M pH7.4磷酸 鹽緩沖液將GTX2,3-葡萄糖氧化酶稀釋至5pg/mL，每孔100pL加入到聚苯乙 烯微孔板微孔中，4。C包被過夜或37。C包被2 3h;(b) 洗滌倒出微孔板微孔中上述液體后，將200 300nl洗滌液加入 微孔中；然后倒出微孔板微孔中的液體，完全除去微孔板微孔中的液體；(c) 封閉每孔微孔加入150 200pL含0.5 3 %牛血清白蛋白的0.01 0.05Mp本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種膝溝藻毒素ＧＴＸ２，３間接競爭ＥＬＩＳＡ檢測方法，其特征在于包括如下步驟：分別將魚貝類樣品提取液和系列濃度的ＧＴＸ２，３標(biāo)準(zhǔn)液加入到抗原預(yù)包被條的微孔中；然后加入抗ＧＴＸ２，３單克隆抗體到每個微孔，混合后孵育；在每個微孔中依次加入生物素化羊抗鼠ＩｇＧ多抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素，孵育；在每個微孔加入顯色液ＴＭＢ底物工作液反應(yīng)后，再在每個微孔中加入終止液終止反應(yīng)；用酶聯(lián)讀數(shù)儀測定每個微孔的ＯＤ值；對照標(biāo)準(zhǔn)液所得的曲線回歸方程，計算出魚貝類樣品中實際的ＧＴＸ２，３濃度。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：向軍儉，賀文妃，唐勇，羅輝武，唐琦，鄧寧，王宏，楊紅宇，
申請(專利權(quán))人：暨南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：81[中國|廣州]