一種可原位同時檢測多種常見小分子藥物的酶標芯片法制造技術

一種可原位同時檢測多種常見小分子藥物的酶標芯片技術屬于生物芯片技術領域。本研究巧妙結合生物芯片技術和酶聯免疫分析方法各自的優勢，開發一種全新的酶標芯片技術，可高通量多人份同時對血、尿等中的多種常見毒品進行檢測，以滿足毒品案件鑒別、禁毒和防毒的需要，同時也力爭為２００８年北京奧運會增添一項新的興奮劑檢測技術。本研究使用高分子多聚物薄膜為基質材料，通過機械手進行點樣，制得酶標芯片。然后通過特異二抗和酶促反應，根據陽性點灰度值判定檢測樣品中毒品的種類和濃度。本研究的檢測結果可用氣－質、液－質聯用等方法進行比對和驗證。

【技術實現步驟摘要】

一種可原位同時檢測多種常見小分子藥物的酶標芯片(Enzyme-link immunosorbentassay array，簡稱ELISA-array)技術，屬于生物芯片

技術介紹
興奮劑(Dope)的原義是一種供賽馬使用的鴉片類麻醉混合劑。當今體育界對興奮劑的定義是能起到增強或輔助增強自身體能或控制能力，達到提高比賽成績的某些藥物或生理物質的總稱。對于判定是否使用興奮劑，國際上的通常慣例是如果在比賽中運動員把違禁藥物以任何形式攝入體內，或者以不正常的方法應用了非正常量的生理物質，這種人為的非法提高運動成績的做法就稱為使用興奮劑。當今世界上濫用興奮劑的情況非常嚴重，以至于連前奧委會主席薩馬蘭奇都認為服用違禁藥品是世界性問題，服用禁藥者擁有更先進的科技水平，反禁藥的斗爭最多只能取得局部勝利，永遠取得不了全面勝利。另一方面，毒品濫用情況泛濫全球，吸毒者超過2億，每年死亡人數20多萬，因吸毒喪失勞動能力的1000多萬人，全球每年銷售總額大于10000億美元，成為僅次于軍火交易的世界第二大貿易。嚴峻的毒品泛濫對人類的生存和發展構成了嚴重的威脅，成為世界性公害。近年來，在國際毒潮的影響下，早在建國初期就已絕跡的毒品問題再次殃及我國，已呈蔓延之勢，吸毒人群波及社會各階層，據不完全統計，中國的吸毒人數已達100多萬，我國已由毒品過境國轉變為毒品過境與毒品消費并存的毒品受害國。毒品泛濫使毒品犯罪日趨嚴重，不僅發案率逐年上升，毒品數量越來越多，涉及地域越來越廣，而且向國際性毒品犯罪發展，嚴重地危害著我國的社會治安和現代化建設事業的順利發展。因此研究開發查禁毒品的新技術、新方法，不斷增強和提高對毒品犯罪的發現和控制能力是十分必要的。現有的小分子藥物檢測(如毒品檢測或者興奮劑檢測)一般采用色譜、液譜和質譜聯用的方法。藥物經過機體的吸收、分布和代謝等過程，殘存于生物樣品中的藥物及其代謝物不僅含量低，而且與多種雜質共存，為微量分析。要進行分析首要的第一個難題就是生物樣品的前處理，不僅要選擇合理的提取方法，還要經過分離和凈化，盡可能地除去雜質后才能進行儀器分析。目前，世界上多采用聯用儀器分析技術，就是對多組分有機化合物既要有分離又要有定性、定量鑒別功能，那就是氣/質(Gas chromatography/Mass spectrometry，GC/MS)、液/質(Liquid chromatography/Mass spectrometry，Lc/Ms)、氣/質/質(Gaschromatography/Mass spectrometry/Mass spectrometry，GC/MS/Ms)等分析法。這些大型分析儀器不僅價格昂貴，操作與維護復雜、難度大，而且一次只能分析一個樣品，分析過程長，難以實現高通量并行檢測的客觀需求。因此，當前國際通行的興奮劑檢測一般并不能檢查所有參加比賽的運動員，而不得不采用隨機抽檢的方式。這種方式顯然不能體現公平競爭的運動精神。生物芯片是于20世紀90年代發展起來的一門新興技術，它的核心思想和優勢就是利用各種手段以實現高通量并行檢測的目的。生物芯片種類繁多，其中一個研究方向就是蛋白質芯片。國內外已經有很多生物技術公司和制藥公司認識到了蛋白質芯片研究的重要意義和前景，正在從不同角度和方向進行著與此相關的研發工作。酶聯免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)簡稱酶標法，是根據酶免疫測定原理發展的一種技術，可以用于各種抗原、抗體的檢測。酶標方法應該說是一種常規的方法，早在1959年Berson等人就專利技術了檢測胰島素含量的放射免疫方法，并因此獲得了諾貝爾醫學獎。1987年有人用放免方法檢測了740名運動員的hCG含量，21人超標，此舉引起國際奧委會注意并很快將hCG列入禁藥名單。2002年，用光刻掩膜真空沉積技術和ELISA法對免疫球蛋白進行分析，研制了適合于快速微量分析的金自組膜免疫芯片。2003年，通過表面等離子體諧振為基礎的生物傳感器芯片和競爭性ELISA法，用于檢測嗎啡和海洛因的主要代謝產物嗎啡-3-葡萄糖苷酸。一般來說，免疫學反應大體可以分為兩個主要類別，即競爭法和夾心法。夾心法具有很大的自身優勢如靈敏準確、可多次放大，對所使用的抗體要求不高(不需要太高的親和力)。但在使用競爭法時要求必須同時擁有兩種可識別抗原分子不同免疫位點的抗體，這一要求對蛋白質類抗原來說很容易實現，因為一個蛋白分子常有多達幾十個甚至數百個免疫識別位點；而對一些小分子物質，例如我們所研究的興奮劑分子來說，這一要求往往難以實現。小分子藥物的分子量大多不足1000，本身僅具有抗原性，而不具有免疫原性(分子量低于10000的物質沒有免疫原性)。小分子藥物必須與大分子的免疫載體(BSA，KLH)相連接，才能夠進行動物免疫。在小分子藥物-大分子載體的連接物中，小分子本身位點是否能夠有效暴露是一個很大問題，迄今為止尚未得到較好的解決，因此高特異性抗小分子抗體的制備非常困難。早期的競爭法一般以放射性同位素作為標記物，標記待檢測分子的標準品。利用待測分子與標記分子競爭結合同一抗體位點的特性，根據放射性強度下降的值來反映被測物濃度。放射性強度越高，則說明體系中的競爭物越少；越低，則說明體系中競爭物越多。當然，人們并不希望過多使用同位素，所以這種方法現在出現了其它一些檢測形式，如使用熒光方法、化學發光方法、電致化學發光方法等。但無論使用何種檢測形式，為了達到一定的靈敏度要求，所有的競爭方法都共同需要一個高親和力的特異抗體作為捕獲分子，這對抗體的制備提出了較高的要求。
技術實現思路
1)整體結構一種在96孔酶標板孔底粘貼點樣后薄膜進行檢測生物分子的新型裝置。特征為采用三維高分子多聚物薄膜或無機聚合物膜，將生物探針分子用機械手按照設計點陣進行點樣，經切割后粘貼于酶標板孔底，用抗體、配體、配對核酸等進行特異識別，然后用原位顯色方法結合圖像采集設備判定被測物的濃度。由于本方法采用通用的96孔酶標板，因此在加樣和操作上易于被人接受并廣泛推廣應用。同時又增加了生物芯片高通量的優勢，通過機械手在一個孔中同時點多個樣品點，同時檢測多種代測物質，使得酶標板的檢測通量大大提高。2)基底材料與DNA芯片不同，蛋白芯片不能直接在原位合成，只能采用點樣或噴墨方法制作。制作蛋白芯片最大的難題在于如何將蛋白與基底材料有效結合的同時，仍能保持其原有的生物活性(免疫原性、抗體特異性)不變。可用于蛋白質芯片的基底材料有很多種，其選擇的基本要求為①靶標蛋白以共價鍵形式與基底表面連接；②其它蛋白、配體或小分子物質能夠特異性地與所固定的蛋白發生反應；③非特異性吸附低；④穩定性好，有較長的保存期。而且蛋白又很容易被自然降解或被細菌吞噬從而導致失活、變性，因此選擇一個好的固定基底材料在制作蛋白芯片過程中就顯得尤為重要。目前常用的基底材料有聚丙烯酰胺凝膠、聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)、硝酸纖維素膜(NC膜)、聚四氟乙烯、聚苯乙烯塑料、納米陶瓷、瓊脂糖凝膠、載玻片等。以載玻片為基底的特點①無滲透性，不同抗體可以在玻片不同區域發生特異反應；②低濃度下即可發生相互作用，目前最低可達100pg/ml；③干燥保存不影響原有免疫活性。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種在９６孔酶標板孔底粘貼點樣后薄膜進行檢測生物分子的新型裝置。特征為采用三維高分子多聚物薄膜或無機聚合物膜，將生物探針分子用機械手按照設計點陣進行點樣，經切割后粘貼于酶標板孔底，用抗體、配體、配對核酸等進行特異識別，然后用原位顯色方法結合圖像采集設備判定被測物的濃度。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：杜宏武，魏玉芝，李紹旭，
申請(專利權)人：杜宏武，魏玉芝，李紹旭，
類型：發明
國別省市：11[中國|北京]