用于測(cè)定候選化合物的ＨＤＣ調(diào)節(jié)活性的熒光極化測(cè)定方法，包括下述步驟：ａ）提供反應(yīng)混合物，包括ＨＤＣ、組氨酸、熒光標(biāo)記的組胺探針、候選化合物以及抗組胺抗體，所述的抗組胺抗體對(duì)組胺相對(duì)于組氨酸的選擇性大于至少１０倍；ｂ）孵育反應(yīng)混合物；ｃ）測(cè)定在測(cè)試化合物存在下是否發(fā)生了ＨＤＣ的抑制，其中熒光極化信號(hào)的增加表明測(cè)試化合物抑制ＨＤＣ的活性。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)的領(lǐng)域涉及用于檢測(cè)HDC活性的熒光極化測(cè)定方法，可以用于疾病診斷以及確證HDC抑制劑。2.
技術(shù)介紹
組胺是一種強(qiáng)效生物活性胺，在多種病理以及生理狀態(tài)中具有活性(Jutel M，Watanabe T，Akdis M，Blaser K，Akdis CAImmune regulation byhistamine.Curr.Opin.Immunol 2002；14735-740)。除了已經(jīng)良好表征的對(duì)急性炎性以及過敏性反應(yīng)的活性外，組胺調(diào)節(jié)抗原-特異免疫反應(yīng)的多個(gè)方面(Schneider E，Rolli-Derkinderen M，Arock M，Dy MTrends in histamineresearchnew functions during immune responses and hematopoiesis.TrendsImmunol 2002；23255-263)。最近的發(fā)現(xiàn)，例如在免疫活性細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)新的組胺受體(H4)以及H1和H2受體對(duì)T輔助細(xì)胞極化中作用的證實(shí)，引起了人們對(duì)組胺觸發(fā)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的極大興趣(Schneider E，Rolli-Derkinderen M，Arock M，Dy M.；Trends Immunol.2002 May；23(5)255-63)。組氨酸脫羧酶(HDC)是組胺生物合成中的限速酶(Watanabe T，Yamatodani A，Maeyama K，Wada HPharmacology ofα-fluoromethylhistidine，a specific inhibitor of histidine decarboxylase.Trends Pharmaceutical Sci1990；11363-367.)。哺乳動(dòng)物HDC是吡哆醛5-磷酸(PLP)-依賴酶大家族中的成員(Christen P，Mehta PFrom Cofactor to enzymes.The molecular evolutionof pyridoxal-5’phosphate-dependent enzymes.Chemical Record 2001；1436-447.)。HDC在大多數(shù)組織中表達(dá)但是最高的水平見于皮膚、GI道以及氣道。HDC是74Kd酶，能轉(zhuǎn)化為更短的54Kd形式(Yatsunami K，Tsuchikawa M，Kamada M，Hori K，Higuchi TComparative studies of humanrecombinant 74-and 54-kDa L-histidine decarboxylase.J.Biol.Chem.1995；27030813-30817)。二種形式在體外都具有活性，但是二者不同時(shí)出現(xiàn)在亞細(xì)胞室中；74Kd形式主要見于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中(Tanaka S，Nemoto K，Yamamura E，Ohmura S，Ichikawa ADegradation of the 74kDa form of l-histidine de-carboxylase via the ubiquitin-proteasome pathway in a rat basophilic/mast cellline(RBL-2H3).FEBS Letters 1997；417203-207)。最近得到的HDC-缺乏小鼠為內(nèi)源性組胺在廣泛的正常以及疾病過程中作用的研究提供了良好的系統(tǒng)(Ohtsu H，Watanabe TNew functions ofhistamine found in histidine decarboxylase gene knockout mice.BiochemBiophys Res Commun 2003；443-447)。HDC-/-小鼠具有下降數(shù)目的肥大細(xì)胞以及下降的粒狀含量如肥大細(xì)胞蛋白酶(Ohtsu H，Tanaka S，Terui T，Hori Y，Makabe-Kobayashi Y，Pejler G，Tchougounova E，Hellman L，Gertsenstein M，Hirasawa N，Sakurai E，Buzas E，Kovacs P，Csaba G，Kittel A，Okada M，Hara M，Mar L，Numayama-Tsuruta K，Ishigaki-Suzuki S，Ohuchi K，Ichikawa A，F(xiàn)alus A，Watanabe T，Nagy AMice lacking histidine decarboxylase exhibit abnormalmast cells.FEBS 2001；50253-56.)。這些小鼠顯示了下降的氣道高反應(yīng)性(Kozma GT，Losonczy G，Keszei M，Komlosi Z，Buzas E，Pallinger E，Appel J，Szabo T，Magyar P，F(xiàn)alus A，Szalai CHistamine deficiency in gene-targetedmice strongly reduces antigen-induced airway hyper-responsiveness，eosinophilia and allergen-specific IgE.International Immunol.2003；15963-973，下降的血管通透性(Ohtsu等Plasma extravasation inducedby dietary supplemented histamine in histamine-free mice.Eur J Immunol.2002；321698-708)、下降的皮膚炎癥(Ghosh AK，Hirasawa N，Ohtsu H，Watanabe T，Ohuchi KDefective angiogenesis in the inflammatory granulation tissue inhistidine decarboxylase-deficient mice but not in mast cell-deficient mice.J.Exp.Med.2002；195973-982.)以及增加的骨密度(Fitzpatrick LA，Buzas E，GagneTJ，Nagy A，Horvath C，F(xiàn)erencz V，Mester A，Kari B，Ruan M，F(xiàn)alus A，BarsonyJ.Targeted deletion of histidine decarboxylase gene in mice increases boneformation and protects against ovariectomy-induced bone loss.Proc Natl AcadSci USA.2003；100(10)6027-32)。因此，強(qiáng)效的HDC活性抑制劑可能可以用于過敏、炎性、免疫性、骨以及心血管疾病。組胺也已經(jīng)證實(shí)是一些類型的癌癥增殖的積極的調(diào)節(jié)劑(Hegyesi H，Somlai B，Varga VL，Toth G，Kovacs本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
用于測(cè)定候選化合物的ＨＤＣ調(diào)節(jié)活性的熒光極化測(cè)定方法，包括下述步驟： ａ）提供反應(yīng)混合物，包括ＨＤＣ、組氨酸、熒光標(biāo)記的組胺探針、候選化合物以及抗組胺抗體，所述的抗組胺抗體對(duì)組胺的選擇性比組氨酸大至少１０倍； ｂ）孵育反應(yīng)混合物； ｃ）測(cè)定在測(cè)試化合物存在下是否發(fā)生了ＨＤＣ的抑制，其中熒光極化信號(hào)的增加表明測(cè)試化合物抑制ＨＤＣ的活性。
【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來華專利技術(shù)】...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：E邁克爾奧古斯特，丹尼爾拉喬特，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：貝林格爾英格海姆藥物公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：US[美國(guó)]
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