離子通道制造技術(shù)

我們公開了具有功能性缺損的內(nèi)源ＴｒｐＭ８基因的轉(zhuǎn)基因非人類動物，其中ＴｒｐＭ８基因包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１、ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２或ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：４所示的核酸序列，或與其有至少７０％序列同一性的序列。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及新鑒定的核酸、由其編碼的多肽、及其制備和用途。更具體地，本專利技術(shù)的核酸和多肽涉及在下文中被稱為“TrpM8”或“TrpM8離子通道”的離子通道。本專利技術(shù)也涉及抑制或活化這種核酸和多肽的作用。
技術(shù)介紹
哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)地評估內(nèi)部和環(huán)境的溫度來保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和避免熱極端。瞬時型感受器電位(TRP)通道形成由不同因子活化的陽離子通道，包括機(jī)械刺激、滲透性、pH和溫度的變化，以及外源性的刺激物，辣椒辣素。這些特化的感覺感受器是在背側(cè)根神經(jīng)節(jié)(DRG)發(fā)現(xiàn)的。離子通道的瞬時型感受器電位(TRP)家族的幾個成員已經(jīng)被認(rèn)為是熱刺激的傳導(dǎo)器，包括熱活化的TRPV1和TRPV2，和冷活化的TRPM8。來自大鼠的冷-和薄荷醇-敏感型感受器(CMRI)最近已經(jīng)被克隆。此感受器是由三叉神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)中的小直徑神經(jīng)元表達(dá)的興奮性離子通道。此通道感受器被低溫(8-28℃)和作為溫度反應(yīng)型感受器的化學(xué)激動劑引起與寒冷感覺相同感受的薄荷醇活化。CNIR1屬于瞬時型感受器電位(TRP)通道亞家族的一員，與其他的溫度感受器、-VR1和VRLI相似，對毒熱有反應(yīng)并將感受信息傳導(dǎo)至脊髓和腦。最近對培養(yǎng)的背根和三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的電生理學(xué)研究已經(jīng)表明，多離子機(jī)制以對低溫的外周檢測為基礎(chǔ)。幾個候選的“冷感受器”，其所有的離子通道蛋白，與這個過程有關(guān)。一個候選物是TRPM8，在由溫度降低和冷卻化合物薄荷醇活化的感覺神經(jīng)元亞群中表達(dá)的非選擇性陽離子通道。經(jīng)培養(yǎng)的大鼠三叉神經(jīng)元與單細(xì)胞RT-PCR的結(jié)合熒光鈣成像，已經(jīng)證實(shí)存在冷反應(yīng)型神經(jīng)元的獨(dú)特亞群，并且TRPM8可能促進(jìn)其中之一的冷傳導(dǎo)。TRPM8優(yōu)選在快速反應(yīng)型、低閾值(低于30℃)、冷敏感型神經(jīng)元的亞組中表達(dá)。小鼠TRPM8的功能被表征為由冷刺激和薄荷醇門控的離子通道，并且其表達(dá)只限于感受疼痛和溫度的DRG神經(jīng)元亞群。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)小鼠TrpM8離子通道還由毒熱(noxious heat)刺激引發(fā)，因此可能在疼痛中起作用。我們也證實(shí)TrpM8離子通道參與緊張和焦慮。專利技術(shù)概述根據(jù)本專利技術(shù)的第一個方面，我們提供具有功能性缺損的內(nèi)源TrpM8基因的轉(zhuǎn)基因非人類動物，其中TrpM8基因包含SEQ ID NO1、SEQID NO2或SEQ ID NO4所示的核酸序列，或與其有至少70％序列同一性的序列。優(yōu)選，轉(zhuǎn)基因的非人動物在TrpM8基因或其部分有缺失。優(yōu)選，其顯示下列表型中的任意一種或組合與野生型動物相比(a)對疼痛的敏感性降低，優(yōu)選如甩尾試驗(yàn)(tail-flick test)所測量；(b)緊張度下降，優(yōu)選如開放區(qū)域試驗(yàn)(open field test)所測量；(c)血漿皮質(zhì)酮水平降低。我們進(jìn)一步提供轉(zhuǎn)基因的非人類動物，其中該動物的TrpM8基因的至少部分或全部被來自另一動物，優(yōu)選另一物種，更優(yōu)選人類的TrpM8基因的序列替代。優(yōu)選轉(zhuǎn)基因的非人類動物是小鼠。優(yōu)選轉(zhuǎn)基因的非人類動物包含功能性缺損的TrpM8基因，優(yōu)選在TrpM8基因中有缺失，其中該TrpM8基因包含SEQ ID NO4中所示的核酸序列或與其有70％序列同一性的序列。根據(jù)本專利技術(shù)的第二個方面，提供本專利技術(shù)第一個方面所述的來自非人類轉(zhuǎn)基因動物的分離的細(xì)胞或組織。根據(jù)本專利技術(shù)的第三個方面，我們提供具有功能性缺損的內(nèi)源TrpM8基因的細(xì)胞，其中該TrpM8基因包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ IDNO4所示的核酸序列，或與其有至少70％序列同一性的序列。作為本專利技術(shù)的第四個方面，提供如上文每項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因的非人類動物、細(xì)胞或組織、或細(xì)胞作為疼痛或緊張模型的用途。根據(jù)本專利技術(shù)的第五個方面，我們提供如上文每項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因的非人類動物、細(xì)胞或組織、或細(xì)胞作為TrpM8相關(guān)疾病模型的用途。在本專利技術(shù)的第七個方面，提供如每項(xiàng)所述的非人類的轉(zhuǎn)基因動物、其分離細(xì)胞或組織、或細(xì)胞在鑒定TrpM8多肽的激動劑或拮抗劑的方法中的用途，所述TrpM8多肽包含SEQ ID NO3或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列或與其有至少70％序列同一性的序列。根據(jù)本專利技術(shù)的第八個方面，我們提供鑒定TrpM8多肽的激動劑或拮抗劑的方法，所述TrpM8多肽具有SEQ ID NO3或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列或與其有至少70％序列同一性的序列，該方法包括將候選化合物施用于動物，優(yōu)選上面所述的野生型動物或如上所述的轉(zhuǎn)基因非人類動物，并且測量下列任一表型的變化(a)對疼痛的敏感性，優(yōu)選以甩尾試驗(yàn)所測量；(b)緊張，優(yōu)選如開放區(qū)域試驗(yàn)所測量；以及(c)血漿皮質(zhì)酮水平。優(yōu)選，該方法通過鑒定能夠使動物顯示出表型(a)-(c)中的任何一種增強(qiáng)的候選化合物來鑒定TrpM8多肽的激動劑。可選或另外地，該方法通過鑒定能夠使動物顯示出表型(a)-(c)中的任何一種或這種表型的減弱的候選化合物來鑒定TrpM8多肽的拮抗劑。根據(jù)本專利技術(shù)的第九個方面，我們提供鑒定TrpM8多肽的激動劑或拮抗劑的方法，所述TrpM8多肽具有SEQ ID NO3或SEQ ID NO5所示氨基酸序列或與其具有至少70％序列同一性的序列，該方法包括將候選的化合物暴露于細(xì)胞或組織，優(yōu)選野生型細(xì)胞或組織，或如上所述的細(xì)胞或組織或細(xì)胞，并且測量該細(xì)胞或該組織的細(xì)胞的電導(dǎo)(conductance)或胞內(nèi)鈣濃度的變化。優(yōu)選，該方法通過鑒定能夠提高該細(xì)胞的電導(dǎo)或胞內(nèi)鈣濃度的候選化合物來鑒定TrpM8多肽的激動劑。可選或另外地，該方法通過鑒定能夠降低該細(xì)胞的電導(dǎo)或胞內(nèi)鈣濃度的候選化合物來鑒定TrpM8多肽的拮抗劑。根據(jù)本專利技術(shù)的第十個方面，提供鑒定適于治療或緩解疼痛或緊張，優(yōu)選TrpM8相關(guān)疾病的化合物的方法，該方法包括使包含SEQ ID NO3或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列或與其有至少70％序列同一性序列的TrpM8多肽接觸候選化合物，并且確定該候選化合物是否是TrpM8多肽的激動劑或拮抗劑。作為本專利技術(shù)的第十一個方面，我們提供了TrpM8多肽用于鑒定治療疼痛或緊張，優(yōu)選治療TrpM8相關(guān)疾病的TrpM8多肽的激動劑或拮抗劑的用途，所述TrpM8多肽包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示氨基酸序列或與其有至少70％序列同一性的序列。根據(jù)本專利技術(shù)的第十二個方面，我們提供了TrpM8多肽用于鑒定治療疼痛或緊張，優(yōu)選治療TrpM8相關(guān)疾病的TrpM8多肽的激動劑或拮抗劑的用途，所述TrpM8多肽包含SEQ ID NO3或SEQ ID NO5所示氨基酸序列或與其有至少70％序列同一性的序列。根據(jù)本專利技術(shù)的第十三個方面，我們提供了具有SEQ ID NO3或SEQ IDNO5所示氨基酸序列或與其有至少70％序列同一性的序列的TrpM8多肽的拮抗劑，該拮抗劑用于治療個體的疼痛或緊張，優(yōu)選治療TrpM8相關(guān)疾病的方法。根據(jù)本專利技術(shù)的第十四個方面，提供了TrpM8多肽的拮抗劑在制備用于治療個體的疼痛或緊張，優(yōu)選TrpM8相關(guān)疾病的藥物組合物中的用途，所述TrpM8多肽具有SEQ ID NO3或SEQ ID NO5所示氨基酸序列或與其有至少70％序列同一性的序列。根據(jù)本專利技術(shù)的第十五個方面，我們提供了治療患有疼痛或緊張，優(yōu)選患有TrpM8相關(guān)疾病的方法，該方法包括向個體施用TrpM8的拮本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
具有功能性缺損的內(nèi)源ＴｒｐＭ８基因的轉(zhuǎn)基因非人類動物，其中該ＴｒｐＭ８基因包含ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２或ＳＥＱＩＤＮＯ：４所示的核酸序列或與其具有至少７０％序列同一性的序列。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：尼古拉布賴斯，約翰狄克遜，索菲梅辛杰，德克贊恩，
申請(專利權(quán))人：帕拉迪姆醫(yī)療有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：GB[英國]