一種親和色譜填料及其制備方法與應用技術

本發明專利技術公開了一種親和色譜填料及其制備方法與應用。本發明專利技術所提供的親和色譜填料，由固相載體和與其連接的配基組成，其中，所述配基為卡那霉素。該親和色譜填料的制備方法，是以重量份數比為２∶１至１５∶１的固相載體和卡那霉素為原料，利用卡那霉素的氨基將其鍵合至固相載體上，得到親和色譜填料。該親和色譜填料可用于從各種物料和體系中將其中所含的溶菌酶加以分離、純化，也可將其用于溶菌酶的分析與測定。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種親和色譜填料及其制備方法與應用，特別涉及該親和色譜填料在分離、純化溶菌酶方面的應用。
技術介紹
溶菌酶(lysozyme)是由129個氨基酸殘基組成的堿性球蛋白，分子量為14.3KD。由于溶菌酶具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的功效，被廣泛應用于食品、醫療及生物工程等諸多領域，因此，分離、純化溶菌酶的研究日益受到關注。在以往溶菌酶的制備技術研究中，鹽析、凝膠過濾、離子交換色譜及親和色譜等方法均已被采用。其中親和色譜法利用酶與其配基之間的專一親和特性，可有效地精制目的酶，且步驟簡單，因而應用親和色譜方法純化溶菌酶一直是研究的熱點。親和色譜是用于生物大分子的分離與純化的一種液相色譜模式，它是根據生物大分子與其配基間所具有的高親和力而設計的一種高選擇性的色譜分離方法。1967年Axen等人首次將具有伯氨基的分子鍵合到以CNBr活化的多糖基質上。此后，大量的親和色譜填料被開發并生產出來，使親和色譜成為了實驗室中廣泛應用的一種分離純化的手段。1978年，Ohlso等人提出了高效親和色譜的概念，以小粒徑高效基質取代軟膠，大大提高了親和色譜的分離效率。在親和色譜中，首先須將配基以共價鍵連接于不溶性載體相上，得到具有固定化配基的親和色譜填料。將這種親和色譜填料填充成親和色譜柱。若將含有目標蛋白質的混合物加到柱上，則只有能與固定化配基表現出明顯親和作用的蛋白質被保留；其他不能識別固定化配基的組分則不受阻礙地流過色譜柱床。然后，改變溶劑的組成便可將目標蛋白質從固定化配基上解離和洗脫下來。與其他經典的蛋白質分離方法比較，親和色譜有許多突出的優點親和色譜幾乎可應用于任何兩種有特異性相互作用的生物分子的分離；親和色譜是選擇性最高的色譜模式，在許多場合下，親和色譜是純化倍數最高的操作，可大大減少操作所需時間、步驟和成本；操作條件溫和，有利于穩定蛋白質的結構和活性，提高蛋白質的活性回收率；適于分離復雜生物體系中低濃度的蛋白質組份。對于親和色譜而言，選擇合適的親和配基是最重要的一環。高效親和色譜的配基可分為兩大類非專一性親和配基和生物專一性相互作用配基。非專一性配基如染料、類染料、固定化和氨基酸類似物等。它們的特點在于便宜易得，容易鍵合且鍵合量大，易于大規模生產，缺點是專一性差，選擇性較低。專一性配基主要是利用抗原—抗體、酶—底物、酶—抑制劑等的生物專一性作用。它們往往有高的選擇性，但其成本高，來源困難。在親和色譜中配基必須具備以下條件在一定條件下，能和欲分離的生物大分子進行專一性結合，所形成復合物的解離常數一般在10-4-10-8mol/L之間；配基和生物大分子結合后，在一定條件下又能解離，而且解離后不能破壞生物大分子的生物活性；配基上必須含有可被利用的官能團，以便用適宜的化學方法將其偶聯到固相載體上，且偶聯后不應影響配基和欲分離生物大分子的專一性結合。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種親和色譜填料。本專利技術所提供的親和色譜填料，由固相載體和與其連接的配基組成，其中，所述配基為卡那霉素?？敲顾貫橐环N廣泛應用的氨基糖苷類抗生素，利用其分子上的氨基，可通過很多方法，如溴化氰法、N-羥基琥珀酰亞胺酯法及羰基二咪唑活化法等，將其鍵合至各種載體上，例如，鍵合于球形、無定型、薄膜或纖維狀的硅膠，可控孔徑玻璃，合成高分子微球，天然高分子凝膠(瓊脂糖、葡聚糖等)或纖維素上，便可制備出親和色譜填料并據以制備出相應的親和色譜柱。由本專利技術的親和色譜填料制備的親和色譜柱也屬于本專利技術的保護范圍。本專利技術的另一個目的是提供一種制備上述親和色譜填料的方法。本專利技術所提供的制備上述親和色譜填料的方法，是以重量份數比為2∶1至15∶1的固相載體和卡那霉素為原料，利用卡那霉素的氨基將其鍵合至固相載體上，得到親和色譜填料。所述制備親和色譜填料的方法，具體可包括以下步驟(1)對固相載體進行預處理；(2)取2至15重量份的經過預處理的固相載體，200℃油浴下抽真空，冷卻后加入40-750重量份的含有質量百分含量為2-10％的3-環氧丙氧丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液，回流2-8h，甲醇洗滌后，以甲醇為溶劑索氏提取2-12h，得到鍵合了環氧基團的固相載體；(3)在鍵合了環氧基團的固相載體中，加入含有一重量份的卡那霉素的磷酸鉀緩沖液，30-80℃下反應12-56h，得到親和色譜填料。其中，步驟(3)中所述磷酸鉀緩沖液的濃度為0.5-3mol/L，pH值為7至8。所述方法中，還包括如下后處理的步驟鍵合了環氧基團的固相載體與卡那霉素在30-80℃下反應12-56h后，過濾，洗滌，抽干，加入10-300重量份的pH值為7至8的2mol/L Tris-HCl緩沖液，室溫下反應1.5-5h，過濾，用水洗滌，最后用甲醇洗滌，真空下烘干。步驟(1)中的預處理可按如下方法進行在2至15重量份的固相載體中，加入100-1500重量份的質量百分濃度為5-15％的HCl溶液，浸泡5-20h后回流2-8h，去除Cl-，干燥。由本專利技術的親和色譜填料制備的親和色譜柱可以從復雜的體系中，例如，從新鮮蛋清中專一性地將溶菌酶分離出來，SDS-PAGE分析證明其純度可達90％以上。固定化的卡那霉素與溶菌酶的相互作用的解離常數可達3.52×10-5mol/L。這種新的親和色譜填料與已有的親和色譜填料，例如使用金屬離子、染料以及糖類分子等為配基的填料相比，具有專一作用力強、安全性高、原料易得、價格低廉的特點?？捎糜趶母鞣N物料和體系中將其中所含的溶菌酶加以分離、純化，也可將其用于溶菌酶的分析與測定。附圖說明圖1A為過空白柱的溶菌酶的色譜1B為過本專利技術的親和柱的溶菌酶的色譜2為pH條件對親和色譜分離的影響圖3為不同蛋白質在親和柱上保留行為的比較圖4為利用前沿色譜法測定固定化卡那霉素與溶菌酶復合物的解離常數圖5為方法重現性實驗圖6為新鮮雞蛋清在卡那霉素固定化的親和柱上的親和色譜7為SDS-PAGE分析結果圖8為圖7中2、3、4泳道譜帶的激光密度掃描9為溶菌酶的活性分析具體實施方式下述實施例中的方法如無特別說明，均為常規方法。實施例1、以硅膠為載體、卡那霉素為配基的親和色譜填料及親和色譜柱的制備1、以硅膠為載體、卡那霉素為配基的親和色譜填料的制備取粒徑為5μm、孔徑300的硅膠1.5g，置于圓底燒瓶中，加入100mL 10％HCl溶液，浸泡18h后在120℃回流8h，以二次去離子水洗至無Cl-(洗滌液滴加AgNO3至無渾濁)，120℃烘干。于100mL圓底燒瓶中加入1.5g預處理過的硅膠，200℃油浴下抽真空，并維持3h。冷卻后加入50mL 5％的3-環氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(GPS)甲苯溶液，120℃回流8h，熱甲醇洗滌3次后，以甲醇為溶劑索氏提取12h，室溫下真空干燥。取1.5g鍵合了環氧基團的硅膠置于25mL圓底燒瓶中，將0.2g卡那霉素溶于10mL磷酸鉀緩沖液(2mol/L，pH7.9)后，加入圓底燒瓶中，60℃下搖床反應48h。反應物過濾，以大量水洗滌，抽干。加入30mL 2mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.9)，室溫下振蕩反應3h，過濾，用大量水洗滌，最后用甲醇洗滌2次，真空下烘干備用。得到以硅膠為載體、以卡那霉素為配基的親和色譜填料。2、以硅膠為載體、不接配基的空白色譜填料的制備取本文檔來自技高網...

【技術保護點】
親和色譜填料，由固相載體和與其連接的配基組成，其特征在于：所述配基為卡那霉素。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉陽，李克安，劉鋒，
申請(專利權)人：北京大學，
類型：發明
國別省市：11[中國|北京]