幽門螺桿菌尿素酶B亞單位的Th表位肽、其編碼DNA、疫苗及其應用制造技術

本發明專利技術提供了三個幽門螺桿菌尿素酶Ｂ亞單位的Ｔｈ細胞表位肽及編碼ＤＮＡ，并提供包含此三個表位肽及額外的一個尿素酶Ｂ亞單位的Ｂ細胞表位（ＳＩＫＥＤＶＱＦ）的疫苗。其中Ｔｈ表位肽是具有下列氨基酸殘基序列之一的多肽：１）具有序列表中序列２、序列３、序列７的氨基酸序列；２）將序列表中的序列２、序列３、序列７的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的替換、缺失或添加而成的衍生多肽。其編碼的ＤＮＡ是下列核苷酸序列之一：１）具有序列表中序列８、序列９、序列１０的核苷酸序列。２）與序列表中序列８、序列９、序列１０具有相同編碼產物的核苷酸序列。包含本發明專利技術多肽的表位疫苗是具有序列表中序列１２中的氨基酸序列的蛋白疫苗。本發明專利技術多肽作為活性成分制成的疫苗或藥物，可以起到清除幽門螺桿菌感染的作用，在醫藥領域具有廣闊的應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于醫藥生物
，涉及來自幽門螺桿菌(Hp)的多肽、其編碼DNA及應用。其中優選的3個多肽為來自尿素酶B亞單位(UreB)的輔助性T淋巴細胞(Th)表位，本專利技術涉及含有這些表位肽的組合物，該組合物可以用于治療和(或)預防幽門螺桿菌感染。本專利技術提供了包含3個優選Th表位及一個B細胞表位(SIKEDVQF)的表位疫苗，此外本專利技術還涉及包含這些Th表位的合成肽疫苗、基因重組亞單位疫苗及核酸疫苗等。
技術介紹
1982年澳大利亞學者Warren和Marshall首先從人胃粘膜中分離培養出幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)，他們的發現使得在過去的20多年中，對于潰瘍病的認識和治療發生了很大的變革。2005年10月3日，諾貝爾獎評審委員會宣布，將2005年度諾貝爾生理學和醫學獎授予這兩位澳大利亞科學家，以表彰他們發現了幽門螺桿菌(Hp)以及這種細菌在胃炎和胃潰瘍等疾病中的作用。研究已證實Hp是慢性胃炎、消化性潰瘍及胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤(MALT)等疾病的重要致病因子，與胃癌的發生相關，世界衛生組織已經把Hp列為胃癌的I類致病因子。有效的治療和根除Hp感染已成為人們關注的焦點。目前臨床主要采用抗生素多聯療法治療Hp感染，雖然可以達到85％的根除率，但存在以下缺點1、藥物療法毒副作用大；2、復雜的聯合用藥導致病人的依從性差；3、藥物不能防止Hp的再感染；4、抗生素治療易產生耐藥性而導致治療失敗；5、對發展中國家病人而言，藥物療法在經濟上也較困難。免疫接種是預防和控制感染性疾病最經濟而有效的方法，鑒于Hp感染的高發病率及其與慢行胃炎、消化性潰瘍以及胃癌、胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤的密切關系，如何通過免疫接種達到防治這些疾病的目的，一直是各國科研人員研究的重點問題。疫苗接種通過有效地調動機體的免疫系統，克服細菌對宿主的免疫逃避來達到預防感染和消除已感染細菌的目的，經濟而簡便，可在人群中大規模運用，并且對耐藥細菌仍然有效，因此研究幽門螺桿菌疫苗具有重要的意義。動物實驗研究表明，疫苗接種可以減少Hp在胃粘模定植，并減輕胃粘膜的炎癥反應，起到預防和治療Hp感染的作用。目前關于Hp的疫苗研究多是采用全菌疫苗或重組亞單位疫苗及核酸疫苗等，其引發的免疫應答與Hp自然感染時的免疫應答相似。Hp自然感染時體內產生強烈的細胞與體液免疫應答，但是感染仍慢性持續化甚至終身感染，說明機體已經對Hp存在免疫耐受，自然感染時產生的免疫應答不能起到保護作用，因而通過疫苗接種的方式清除Hp就必須在抗原選擇以及表位水平對抗原進行改造，激發更有效的免疫應答。表位疫苗是近年隨分子生物學及免疫學的進展而發展起來的一種新的疫苗形式，可以誘導機體產生特異性的免疫應答，并且其副作用輕微、安全性好，是目前疫苗研究的一個新的方向，廣泛應用于病毒、腫瘤、及慢性感染性疾病的免疫預防和治療。借鑒表位疫苗在其它慢性感染性疾病中的研究成果，以Hp表位為基礎設計的疫苗有可能打破機體的免疫耐受，達到預防和治療Hp感染的目的。細胞免疫尤其是CD4+T淋巴細胞(也稱為輔助性T淋巴細胞，Th細胞)在抗Hp感染中起到了重要的作用。CD4+T淋巴細胞識別的抗原是外來抗原經抗原提呈細胞(APC)處理后與MHC□類分子結合并提呈到細胞表面的短肽，即Th表位。被Th表位激活的CD4+T淋巴細胞可以輔助B細胞及CTL細胞發揮免疫效應。在Hp感染中CD4+T除了發揮輔助功能外還直接發揮免疫效應并且介導免疫保護應用MHC I類分子敲除小鼠和MHC II類分子敲除小鼠的研究模型發現，MHC II類分子敲除的小鼠不能夠對Hp的感染起到保護作用，CD4+T淋巴細胞識別的是結合到MHC□類分子上的短肽(即Th表位)，而CD8+T淋巴細胞識別的是結合到MHC□類分子上的短肽(即CTL表位)，因此提示CD4+T淋巴細胞而非CD8+T淋巴細胞對Hp感染起到了免疫保護作用。因而要激發對Hp的保護性免疫應答，必須激發機體的CD4+T淋巴細胞免疫應答。尿素酶(Urease)是Hp的主要致病因子，對Hp在人胃粘膜定居起著重要作用，在胃部的酸性環境中，一般細菌很難存活，但是Hp的尿素酶能夠水解尿素而釋放氨，在菌體周圍形成一層“氨云”保護Hp抵抗胃酸而在胃粘膜定植，并且釋放的氨能直接損害胃粘膜。尿素酶在Hp菌體中的含量高，占可溶性蛋白的6％，由A和B兩個亞單位組成，其中B亞單位(UreB)為尿素酶活性亞基，在各菌株中相對保守，研究證實UreB具有很強的抗原性，是較好的Hp疫苗的候選抗原。目前關于Hp的表位研究主要是針對尿素酶的B細胞表位開展的，研究發現針對尿素酶B亞單位(UreB)不同表位的單抗有的抑制尿素酶的活性，有的則增強尿素酶的活性，有學者嘗試用UreB上部分片段來制備疫苗，產生抑制尿素酶活性的中和抗體。而目前研究表明抗Hp感染的免疫保護是由CD4+T淋巴細胞介導的，因此采用免疫手段預防和治療Hp感染必須激發機體的CD4+T淋巴細胞免疫應答，但遺憾的是目前還未有人鑒定出Hp的Th細胞表位，因此本專利技術從鑒定Hp的尿素酶B亞單位的Th表位入手，研究預防和治療Hp感染的方法。本專利技術的思路如下最初的研究以BALB/c(H-2d)小鼠為動物模型，在BALB/c(H-2d)小鼠的動物模型上研究Hp的表位疫苗，采用生物軟件預測了UreB可能H-2d限制性的Th表位，并以CD4+T淋巴細胞增殖試驗進行篩選和鑒定，獲得了3個UreB的Th表位肽。根據表位研究的理論，存在雜合性T細胞表位(promiscuous T cell epitope)或通用T細胞表位(universalT cell epitope)的概念，即一些輔助性T細胞表位能夠與多種MHC-II類分子結合，可以較少的受MHC分子的限制。后來又提出超型和超基序的概念，超型(HLA Supertype)是指能與一種表位肽結合的多種HLA分子(人的MHC分子)，與之相對應的能與多種HLA結合的表位肽稱為“超基序”(Supermotif)，用這種超基序表位制備疫苗可以克服MHC限制性的問題，獲得廣泛的保護性。而在小鼠的遺傳背景下鑒定出的表位是否也具有這種特性，本專利技術人又收集了Hp感染患者的外周血淋巴細胞(PBMC)作為效應細胞，觀察了此3個表位肽對人的PBMC的作用，發現這3個表位肽也可以刺激人的PBMC增殖。因此本專利技術的表位肽可以用來研制人或小鼠用的Hp表位疫苗，并可以用來開發預防或治療Hp感染的多肽藥物。此外本專利技術在鑒定Hp的UreB的Th表位基礎上專利技術了一種基于表位肽的疫苗并提供了表位疫苗的設計方法和制備方法，動物實驗表明此疫苗具有良好的免疫原性。
技術實現思路
本專利技術經過深入而廣泛的研究，對Hp的UreB蛋白進行計算機軟件分析的基礎上，選擇性的合成了7條可能誘導機體產生Th細胞免疫應答的多肽，通過CD4+T淋巴細胞增殖試驗，篩選出3個Th表位肽，并對其免疫特性進行評價，發現此3個表位肽可以在BALB/c小鼠體內引發針對UreB的特異性的應答，并且此3個表位肽能夠刺激Hp感染者的外周血淋巴細胞增殖，可以用于人用的疫苗及藥物的開發。此外獲得一種基于3個表位肽的表位疫苗，動物實驗中顯示了良好的免疫原性。具體內容如下一、本專利技術第一個方面，提本文檔來自技高網...

【技術保護點】
三個來自幽門螺桿菌尿素酶Ｂ亞單位的輔助性Ｔｈ細胞表位肽。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：鄒全明，吳超，石云，周維英，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第三軍醫大學，
類型：發明
國別省市：85[中國|重慶]