診斷SARS冠狀病毒感染的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及檢測(cè)在樣本中是否存在ＳＡＲＳ冠狀病毒的抗體的方法，該方法是基于發(fā)現(xiàn)了ＳＡＲＳ冠狀病毒的Ｓ、Ｍ、Ｅ、Ｎ和Ｕ２７４蛋白具有抗原性。這樣的方法可以被用于診斷患者是否已經(jīng)被ＳＡＲＳ冠狀病毒感染或暴露于ＳＡＲＳ冠狀病毒。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了抗ＳＡＲＳ冠狀病毒的Ｓ、Ｍ、Ｅ、Ｎ和Ｕ２７４蛋白質(zhì)的抗體。（*該技術(shù)在2024年保護(hù)過期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)主要涉及診斷病毒感染的方法，尤其是診斷SARS冠狀病毒感染的方法。
技術(shù)介紹
新出現(xiàn)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)是一種具有全球意義的嚴(yán)重的呼吸疾病。被感染的患者可以表現(xiàn)出非典型性肺炎的癥狀，SARS與非典型性肺炎的早期的、精確的區(qū)分是成功控制這一高度傳染性疾病的關(guān)鍵。SARS病毒的高度傳染性特性以及高死亡率在日益全球化的世界可以是具破壞性的和高代價(jià)的。當(dāng)2003年SARS在中國(guó)廣東省內(nèi)的起源地以外流行擴(kuò)散時(shí)，世界衛(wèi)生組織(WHO)迅速地認(rèn)識(shí)到了這一點(diǎn)，WHO歷史上第一次發(fā)布了全球警報(bào)。這次爆發(fā)影響了超過8,098人，并在短短6個(gè)月期間波及到超過29個(gè)國(guó)家和地區(qū)，死亡率達(dá)到15％。顯然，這一疾病并非一個(gè)局部的問題，而是具有對(duì)公共衛(wèi)生部門以外的其它部門的深遠(yuǎn)影響。由于在2004年1月，新的病例似乎要重新出現(xiàn)，迅速鑒定和隔離被感染患者的緊迫性仍然存在。在許多國(guó)家，為了降低接觸到可能已經(jīng)暴露于引起SARS的病毒的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)那些在被SARS感染的國(guó)家旅行過的人、與SARS患者直接接觸過的人和體溫超過38℃的人施行了嚴(yán)格的隔離令。在感染的初期對(duì)該疾病進(jìn)行早期診斷能避免不必要的隔離、降低有關(guān)人員的應(yīng)激，并幫助醫(yī)生決定出適當(dāng)?shù)尼t(yī)療行為和/或治療。因此，在具備確定性和正確度的前提下，盡可能早地鑒定出SARS患者是至關(guān)重要的。一種新的冠狀病毒被鑒定為SARS(1-4)的病原。冠狀病毒是包膜病毒，其包含一27.6-36kb長(zhǎng)的單鏈、正義RNA基因組。對(duì)新的SARS冠狀病毒(SARS CoV)的核苷酸序列的分析表明該病毒基因組近30kb長(zhǎng)(5，6)，并包含了14個(gè)潛在的開放閱讀框(ORF)(5)。但是，就如何檢測(cè)、診斷和治療該疾病而言還有更多待認(rèn)識(shí)的東西。因?yàn)闆]有藥物或疫苗可用于該病，被感染患者的快速鑒定和隔離仍然對(duì)于疾病的控制極其重要。最初，當(dāng)SARS被首次鑒定時(shí)，最初的疾病控制依賴于旅游和接觸史，以及所表現(xiàn)出來的癥狀。后來，隨著對(duì)SARS-CoV基因組的鑒定，幾種通過PCR基于病毒RNA序列的檢測(cè)的診斷檢測(cè)被設(shè)計(jì)出來并且是現(xiàn)在可以利用的。基于這些方法，WHO已經(jīng)修正了其對(duì)于病例鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。但是，現(xiàn)有的用于PCR的方案未脫離它們的局限性。盡管靈敏度高，這樣的檢測(cè)具有固有的問題全世界的科學(xué)家和臨床醫(yī)師都不確定來自患者的何種樣本(呼吸道樣本、唾液、糞便、血液或結(jié)膜液)提供了最佳的可復(fù)制RNA的制備；RNA提取方法不簡(jiǎn)單，如果做得不好，可能制備到不能用于將病毒RNA轉(zhuǎn)化為DNA的逆轉(zhuǎn)錄步驟的RNA制劑；如果必需以幾對(duì)引物進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，則提取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR的全過程是耗時(shí)的。此外，擴(kuò)增方法可能伴隨著假陽(yáng)性結(jié)果，如2003年8月在加拿大觀測(cè)到一些被其它人冠狀病毒感染的患者最初通過PCR方法被檢測(cè)為SARS陽(yáng)性。PCR實(shí)驗(yàn)室的污染始終是個(gè)問題，這對(duì)于SARS會(huì)導(dǎo)致不必要的隔離。在新加坡所獲得的結(jié)果表明，當(dāng)使用不同的臨床樣本時(shí)，由PCR診斷方法所提供的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPVs)在56.7％至83.8％之間變動(dòng)(A.E.Ling，″SARS-the Singapore laboratory experience″，presented at theWHO Conference on SARS Research，Singapore，Republic of Singapore，19 June 2003)。在一個(gè)最近的報(bào)道中(7)，對(duì)兩個(gè)WHO的SARS逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)室的PCR(RT-PCR)方案進(jìn)行了評(píng)估，所得發(fā)現(xiàn)確認(rèn)RT-PCR具有相似的缺點(diǎn)。因此，當(dāng)獲得陰性結(jié)果時(shí)，現(xiàn)行的PCR方法不能夠排除SARS病毒的存在，也不能排除由于實(shí)驗(yàn)室污染導(dǎo)致錯(cuò)誤檢出率的可能性。包括間接免疫熒光測(cè)定(IFA)、對(duì)病毒分離物的典型組織培養(yǎng)和用于診斷的細(xì)胞培養(yǎng)物的電子顯微鏡術(shù)在內(nèi)的診斷方法往往是耗時(shí)的或在技術(shù)上要求很高。因此替代方法對(duì)于有效地控制該疾病是非常關(guān)鍵的。盡管將新的冠狀病毒，SARS-CoV鑒定為SARS的病原使得有可能開發(fā)出不同的檢測(cè)方法，如WHO所建議的那樣仍然要優(yōu)先提供用于實(shí)驗(yàn)室診斷的工具。迄今為止，仍然沒有用于診斷SARS的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)，不管這樣的檢測(cè)是基于抗原的還是基于抗體的。用標(biāo)準(zhǔn)化板或通過使用大量臨床樣本的試驗(yàn)檢測(cè)新開發(fā)的試劑盒將提供克服該缺點(diǎn)的有用信息。專利技術(shù)概述一方面，本專利技術(shù)提供了一種用于檢測(cè)是否存在SARS冠狀病毒(CoV)的抗體的方法，該方法包括在足以使得抗體能與抗原形成復(fù)合物的條件下，用包含抗體的樣本接觸SARS CoV抗原一段足以使得抗體能與抗原形成復(fù)合物的時(shí)間的步驟；其中所述抗原含有一種選自S、M、E、N、U274及其免疫原性片段的蛋白質(zhì)；且其中所述抗體與所述蛋白質(zhì)間的特異性結(jié)合指示該樣本含有對(duì)SARS CoV具有特異性的抗體。該方法可以被用于檢測(cè)某人是否已經(jīng)被SARS CoV感染或暴露于SARS CoV，其中含有抗體的樣本來自被檢測(cè)的人，其中所述抗體與所述蛋白質(zhì)間的特異性結(jié)合指示該人已經(jīng)被SARS CoV感染或暴露于SARS CoV。本專利技術(shù)還提供了商品化試劑盒。一方面，本專利技術(shù)提供了一種用于檢測(cè)在某一樣本中是否存在SARS冠狀病毒(CoV)的抗體的商品化試劑盒，其包含一種SARS CoV抗原，該SARS CoV抗原包含一種選自S、M、E、N、U274及其免疫原性片段的蛋白質(zhì)；和檢測(cè)來自樣本的抗體與所述抗原間的復(fù)合的工具。另一方面，本專利技術(shù)提供了一種用于檢測(cè)某人是否已經(jīng)被SARS冠狀病毒(CoV)感染或暴露于SARS CoV的商品化試劑盒，其包含一種SARS CoV抗原，該SARS CoV抗原包含一種選自S、M、E、N、U274及其免疫原性片段的蛋白質(zhì)；和檢測(cè)所述抗原與針對(duì)該抗原的抗體的復(fù)合的工具，其中所述樣本是被檢測(cè)的人的含有抗體的樣本。另一方面，本專利技術(shù)提供了一種分離的抗體，其針對(duì)抗原性SARSCoV蛋白，其中所述抗原SARS CoV蛋白是S、M、E、N、U274或其免疫原性片段的蛋白質(zhì)。本專利技術(shù)的抗體被用于檢測(cè)樣本中是否存在SARS CoV的S、M、E、N或U274蛋白。因此，在另一方面，本專利技術(shù)提供了檢測(cè)是否存在S、M、E、N或U274 SARS CoV蛋白的方法，該方法包括在足以使得抗體能與抗原形成復(fù)合物的條件下，用含有抗原的樣本接觸抗體一段足以使得抗體能與抗原形成復(fù)合物的時(shí)間，所述抗體針對(duì)一種選自S、M、E、N和U274的蛋白質(zhì)；其中所述抗體與所述抗原間的特異性結(jié)合指示該樣本含有包含S、M、E、N、U274或其免疫原性片段的抗原。通過閱讀以下對(duì)本專利技術(shù)的特定實(shí)施方式的描述以及附圖，本專利技術(shù)的其它方面和特征對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。附圖說明在附圖中，僅以舉例的方式對(duì)本專利技術(shù)的實(shí)施方式進(jìn)行說明，其中圖1是對(duì)應(yīng)于結(jié)構(gòu)蛋白S、M、N和E以及特有蛋白(UX)的ORF的結(jié)構(gòu)組成和表達(dá)的示意圖，其中X表示由各ORF所編碼的氨基酸的數(shù)；相應(yīng)的被標(biāo)注的ORF 1-14被指出來；圖2圖示的是Western印跡分析，表明在患者血清中存在抗各種SARS-CoV病毒蛋白的抗體；圖3圖示的是通過SDS-PAGE分析并用考馬斯亮藍(lán)R-250(Bio-Rad)染色的細(xì)菌表達(dá)的GST-U274、GST-U122、GST-N和GST蛋白；本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于檢測(cè)是否存在ＳＡＲＳ冠狀病毒（ＣｏＶ）的抗體的方法，該方法包括在足以使得抗體與抗原形成復(fù)合物的條件下，將ＳＡＲＳＣｏＶ抗原與含有抗體的樣本接觸一段足以使得抗體與抗原形成復(fù)合物的時(shí)間的步驟，其中所述抗原包含一種選自Ｓ、Ｍ、Ｅ、Ｎ、 Ｕ２７４及其免疫原性片段的蛋白質(zhì)；且其中所述抗體與所述蛋白質(zhì)間的特異性結(jié)合指示該樣本含有對(duì)ＳＡＲＳＣｏＶ具有特異性的抗體。

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來華專利技術(shù)】...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳燕如，吳佩燕，伯特拉姆克林頓菲爾丁，申碩，林成義，洪萬進(jìn)，阮一駿，衛(wèi)嘉玲，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：新加坡科技研究局，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：SG[新加坡]