氨基酸的分析方法技術

本發明專利技術涉及一種氨基酸的分析方法。在Ｃ↓［１８］柱上，以ｐＨ２－３或６－７的磷酸三乙胺（ＴＥＡＰ）／乙腈（ＡＣＮ）為流動相高效液相色譜分離氨基酸（ＡＡ）的２，４－二硝基氟苯（ＤＮＦＢ）衍生物。柱溫３５℃，３６０ｎｍ紫外檢測。本發明專利技術使用磷酸三乙胺（ＴＥＡＰ）／乙腈（ＡＣＮ）流動相，提高了分離結果的重現性。通過選擇水相緩沖區間和在區間內微調ｐＨ值，使分析方法適用于不同品牌色譜柱和各種試樣類型，解決了氨基酸混合物的分析，并給出準確的結果。本發明專利技術不需增加設備，即可適合于一般ＨＰＬＣ分析室采用。應用范圍包括各種氨基酸的分析以及其它物質轉化為氨基酸后的間接分析，還包括除氨基酸以外其它能與ＤＮＦＢ進行定量衍生反應物質的分析。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及，基于以磷酸三乙胺/乙腈為流動相反相分離氨基酸-2，4-二硝基氟苯衍生物，使用通常的高效液相色譜儀和色譜條件，不再需要其它的儀器配置，就可以完成各種氨基酸試樣的分析，并給出準確的結果。
技術介紹
氨基酸(amino acid，AA)試樣比較復雜，常見的AA有20多種，色譜分析方法必須有足夠的選擇性，以分辨試樣中所要測定的AA。大多數AA對紫外光無明顯的吸收，為了檢測，最常用的手段是使AA分子中的氨基與衍生劑反應，生成具有紫外吸收或熒光性質的衍生物。通常采用兩種途徑分析AA試樣。一種是借助離子交換機理先使AA彼此分離，再用柱后衍生進行檢測。這是一般AA分析儀所使用的辦法。另一途徑是，AA經柱前衍生后，以反相色譜分離AA的衍生物。柱前衍生法分離對儀器設備沒有特殊的要求，同時采用反相分離模式，但要求衍生反應能使每種AA幾乎完全地生成相應的特定產物，且有足夠的檢測靈敏度。在早期的文獻報道中，AA經2，4-二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生，反相分離衍生物AA-DNFB，分離DNFB-AA是以60mM醋酸鈉(pH＝4.45)為水相，以甲醇為有機相，在C18柱上進行梯度洗脫。后來，大多使用pH＝6.5-7的醋酸鹽緩沖液-乙腈體系作為流動相，使異亮氨酸和亮氨酸之間有足夠的分離度。中國專利CN 1053128A公開了十八種復合氨基酸注射液的高效液相色譜分析方法，它以2，4-二硝基氟苯作衍生試劑，用柱前衍生化法對十八種復合氨基酸注射液進行定量測定。用定量稀釋配制檢測液，以一定濃度和pH值的流動相乙腈和流動相醋酸鈉和醋酸緩沖液作梯度洗脫劑。實驗表明，反相分離AA-DNFB對流動相pH值的變化很敏感，精確控制流動相pH值是至關重要的。當使用接近中性的醋酸鹽溶液作為流動相的組分，一個明顯的問題是，流動相的酸度遠離該緩沖液的緩沖區間，此方法的耐用性(robustness)就得不到保證。不同日期配制的流動相和不同品牌，甚至同一品牌不同批號的色譜柱都可能影響DNFB-AA衍生物的色譜分離結果。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種。用磷酸三乙胺/乙腈為流動相反相分離氨基酸-2，4-二硝基氟苯衍生物，可以克服現有技術之不足。本專利技術以磷酸鹽代替原有的醋酸鹽，使用磷酸三乙胺(TEAP)/乙腈(ACN)流動相體系，提高了分離結果的重現性。本專利技術耐用性好，易于為一般實驗室所采用。通過選擇水相緩沖區間和在區間內微調pH值，使分析方法適用于不同品牌色譜柱和各種試樣類型。不需增加設備，即可為一般HPLC分析室采用。本專利技術包括使用高效液相色譜儀，AA經2，4-二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生，反相分離衍生物AA-DNFB，以磷酸三乙胺/乙腈為流動相梯度洗脫或等度洗脫，在分析柱上反相分離氨基酸-2，4-二硝基氟苯衍生物，再用外標法定量分析計算出氨基酸的含量。本專利技術包括下述步驟1)分別用HCl溶液作溶劑制備氨基酸標準溶液和試樣溶液；2)分別取標準溶液和試樣溶液于為其體積10倍量的容量瓶中，加入0.5MNaHCO3，標準溶液或試樣溶液與NaHCO3的體積比為1∶1；再加入1％2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液，與標準溶液或試樣溶液的體積比為0.5-1∶1，搖勻；置于60℃下加熱60分鐘，冷卻至室溫，用0.1M pH為6.5的磷酸鹽緩沖液沖至刻度，搖勻，備用；3)使用包括泵、混合器、恒溫箱、紫外檢測器以及工作站所組成的HPLC儀。在C18分析柱上，以的TEAP/ACN為流動相，梯度洗脫或等度洗脫分離AA-DNFB；色譜條件如下分析柱C18，5μm，250×4.6mm流動相AACN B36mM TEAP，pH2-3或6-7洗脫方式 梯度洗脫或等度洗脫檢測 UV300-380nm，溫度 20-45℃，4)用外標法定量分析計算試樣中AA的濃度＝(A試樣/A標準)×C標準A試樣試樣色譜圖中AA的峰面積A標準標準色譜圖中AA的峰面積C標準標準溶液AA的濃度。本專利技術的具體實施方案包括下述步驟1)分別用0.1M HCl作溶劑制備AA標準溶液和試樣溶液；2)分別取1mL標準溶液和樣品溶液于10mL棕色容量瓶中，加入1mL 0.5MNaHCO3，搖勻。再加入0.5-1mL 1％DNFB的乙腈溶液，搖勻；置于60℃下加熱60分鐘，冷卻至室溫，用0.1M pH為6.5的磷酸鹽緩沖液沖至刻度，搖勻，備用。3)使用包括泵、混合器、恒溫箱、紫外檢測器以及工作站所組成的HPLC儀。在C18分析柱上，以的TEAP/ACN為流動相，梯度洗脫或等度洗脫分離AA-DNFB。色譜條件如下分析柱C18，5μm，250×4.6mm流動相AACN B36mM TEAP，pH2-3或6-7洗脫方式 梯度洗脫或等度洗脫檢測 UV300-380nm，優選360nm，溫度 20-45℃，優選35℃；4)用外標法定量分析計算試樣中AA的濃度＝(A試樣/A標準)×C標準A試樣試樣色譜圖中AA的峰面積A標準標準色譜圖中AA的峰面積C標準標準溶液AA的濃度。本專利技術采用了磷酸鹽代替原有的醋酸鹽，提高了方法的耐用性。在該緩沖體系中，三乙胺的陽離子作為磷酸根的對離子，而不是鉀或鈉離子。磷酸鹽的緩沖區間是pH＝2-3和6-8。在所述的AA分析方法中，以36mM磷酸三乙胺，pH＝2-3和6-7水溶液/ACN流動相體系洗脫AA-DNFB(2，4-二硝基氟苯)。其次，流動相的酸度影響分離選擇性，以不同pH的TEAP為水相，AA分離選擇性顯示很大的差異，這為優化色譜條件提供了方便。此外，三乙胺的加入可抑制固定相上殘留硅羥基對分離的影響。本專利技術使用磷酸三乙胺(TEAP)/乙腈(ACN)流動相，提高了分離結果的重現性。通過選擇水相緩沖區間和在區間內微調pH值，使分析方法適用于不同品牌色譜柱和各種試樣類型(例如注射液類、或原料藥中主要成分的測定等)，解決了氨基酸混合物的分析，并給出準確的結果。本專利技術不需增加設備，即可適合于一般HPLC分析室采用。應用范圍擴大，包括各種氨基酸的分析以及其它物質轉化為氨基酸后的間接分析，還包括除氨基酸以外其它能與DNFB進行定量衍生反應物質的分析。附圖說明圖1是以36mM TEAP，pH6-7/ACN為流動相腎病注射液色譜圖。圖2是以36mM TEAP，pH6-7/ACN為流動相肝病注射液色譜圖。圖3是以36mM TEAP，pH2-3/ACN為流動相腎病注射液色譜圖。圖4是以36mM TEAP，pH2-3/ACN為流動相肝病注射液色譜圖。圖5是以36mM TEAP，pH2-3/ACN為流動相丙谷酰胺酸解液色譜圖。圖6是以36mM TEAP，pH2-3/ACN為流動相苯丙氨酸色譜圖。具體實施例方式以下結合實施例進一步說明本專利技術。實施例1 腎病注射液(Amino acid for renal insufficiency，Hoechst MarionRoussel公司生產)和肝病注射液(Amino acid preparation for hepaticinsufficiency，Hoechst Marion Roussel公司生產)中AA的分析1.試劑1.1.0.1M HCl 4mL鹽酸與480mL水相混合。1.2 1％DNFB1g DNFB溶于100mL乙腈中。1.3.0.5M 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種氨基酸的分析方法，它包括的步驟是使用高效液相色譜儀，ＡＡ經２，４－二硝基氟苯柱前衍生，反相分離衍生物氨基酸－２，４－二硝基氟苯衍生物，其特征在于：以磷酸三乙胺與乙腈為流動相梯度洗脫或等度洗脫，在分析柱上反相分離氨基酸－２，４－二 硝基氟苯衍生物，再用外標法定量分析計算出氨基酸的含量。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：朱彭齡，朱潤之，
申請(專利權)人：天津藥業研究院有限公司，
類型：發明
國別省市：12[中國|天津]