本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種檢測(cè)呼吸道病原的核酸的試劑盒，其包括CRISPR?Cas檢測(cè)體系：如本發(fā)明專利技術(shù)所述的crRNA、Cas蛋白和核酸探針。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了一種呼吸道病原的核酸的檢測(cè)方法、一種分離的核酸、crRNA、引物對(duì)及其應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)的試劑盒和檢測(cè)方法不依賴于大型儀器而可通過(guò)肉眼直接進(jìn)行結(jié)果觀測(cè)，在溫和的條件即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，檢測(cè)更方便；使用本發(fā)明專利技術(shù)的試劑盒和檢測(cè)方法可用于高效、快速地檢測(cè)/診斷呼吸道病原(例如甲型流感、乙型流感以及新型冠狀病毒等)，特異性和靈敏度均較高，可用于呼吸道病原的檢測(cè)與篩查，例如快速區(qū)分包括甲型流感、乙型流感以及新型冠狀病毒在內(nèi)的多種呼吸道病原。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種檢測(cè)呼吸道病原的核酸的試劑盒、檢測(cè)方法及應(yīng)用
本專利技術(shù)屬于生物
，具體涉及一種檢測(cè)呼吸道病原的核酸的試劑盒、檢測(cè)方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
COVID-19案例很快出現(xiàn)在世界各國(guó)，并被世界衛(wèi)生組織(WorldHealthOrganization，WHO)宣布為世界性的公共衛(wèi)生威脅。雖然目前報(bào)道COVID-19的中位發(fā)作時(shí)間為4-5天，但有一小部分感染者是在14天隔離之后才出現(xiàn)癥狀。COVID-19最常見的癥狀是咳嗽和發(fā)燒。不過(guò)，也有一定比例的病人并不呈現(xiàn)癥狀，包括X光檢測(cè)及CT檢測(cè)。COVID-19出現(xiàn)癥狀時(shí)間的不確定以及無(wú)癥狀感染的情況給疾病的早期精準(zhǔn)檢測(cè)帶來(lái)了極大障礙，因而也使得疾病防控極具挑戰(zhàn)。這使得COVID-19病原核酸的分子檢測(cè)變得尤為重要。引起COVID-19的病原已經(jīng)被確認(rèn)為是β屬冠狀病毒，被命名為SARS-CoV-2。和其他冠狀病毒類似，SARS-CoV-2是單鏈、正義的RNA病毒。SARS-CoV-2和SARS-CoV以及中東呼吸綜合癥冠狀病毒(MERS-CoV)分別具有79％和50％的核酸相似性。針對(duì)COVID-19的現(xiàn)有分子診斷方法主要是基于反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)。SARS-CoV-2的E、N以及ORF1ab基因是常用的RT-PCR的靶標(biāo)基因。高通量的RT-PCR平臺(tái)也已被研發(fā)出來(lái)用于大規(guī)模的診斷。不過(guò)，RT-PCR通常依賴于特別的、大型的儀器，因此大規(guī)模的RT-PCR檢測(cè)往往局限于在醫(yī)院的病人。最近研究表明，ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicrRepeats(CRISPR)技術(shù)可用于病原的低成本、便攜式的分子檢測(cè)。CRISPR以及CRISPR-associatedgenes(Cas)基因是細(xì)菌抵御外源病毒感染的免疫系統(tǒng)。CRISPR的模塊特性使得此技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因組工程中。基于CRISPR的病原核酸的分子診斷依賴于Cas核酸酶的RNA或DNA的靶向活性。同時(shí)，不同CRISPR系統(tǒng)可以組合實(shí)現(xiàn)對(duì)病原的多重檢測(cè)。在最近中國(guó)爆發(fā)的非洲豬瘟疫情中，很多基于CRISPR-Cas12a的診斷平臺(tái)被開發(fā)出來(lái)。目前作為新發(fā)傳染病的新型冠狀病毒，其亞基因組表達(dá)譜尚未被清晰闡明，各個(gè)基因的表達(dá)情況以及各個(gè)基因片段對(duì)擴(kuò)增及CRISPR-Cas檢測(cè)的敏感性也不清楚，能否設(shè)計(jì)出針對(duì)新型冠狀病毒(簡(jiǎn)稱新冠)、甲型流感病毒(簡(jiǎn)稱甲流)以及乙型流感病毒(簡(jiǎn)稱乙流)等呼吸道病原的且特異性高、無(wú)交叉反應(yīng)的檢測(cè)方法等本身目前仍然是未被闡明的科學(xué)問(wèn)題。目前檢測(cè)新型冠狀病毒時(shí)所使用的傳統(tǒng)RT-qPCR方法較容易誤檢，且不太容易區(qū)分新型冠狀病毒和其他流感如甲型流感病毒和乙型流感病毒的區(qū)別，這三種在臨床表現(xiàn)上的癥狀是十分相似的，而實(shí)際應(yīng)用時(shí)也發(fā)生了將新冠誤診為流感的案例(Kongetal.,2020,NatMicrobiol)。此外，基于CRISPR-Cas12a的病原檢測(cè)技術(shù)已有報(bào)道(Gootenbergetal,2017,Science；Gootenbergetal,2018,Science；Chenetal,2017,Science；)，特別是針對(duì)新型冠狀病毒的CRISPR檢測(cè)平臺(tái)也已研發(fā)成功(Wangetal,2020,SciBull；Guoetal,2020,CellDiscov；Broughtonetal,2020,NatBiotech)，不過(guò)這些研究多側(cè)重原理性的技術(shù)研發(fā)，對(duì)技術(shù)實(shí)現(xiàn)病原特異性檢測(cè)的研究不夠深入，如沒(méi)有對(duì)各個(gè)病原亞型間特異性進(jìn)行研究，同時(shí)并未明確不同探針組合間的交叉反應(yīng)(如病原A探針和病原B探針在兩種病原間是否存在交叉反應(yīng))。因此，急需一種既高效快速、又具有較高的特異性和靈敏度、且檢測(cè)多種呼吸道病原時(shí)無(wú)交叉反應(yīng)的引物及crRNA探針，以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種呼吸道病原的特異性檢測(cè)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了克服現(xiàn)有檢測(cè)呼吸道病原(例如新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)、甲型流感、乙型流感)的方法依賴于大型儀器、檢測(cè)不方便等缺陷，提供了一種檢測(cè)呼吸道病原的核酸的試劑盒、一種呼吸道病原的核酸的檢測(cè)方法、一種分離的核酸、crRNA、引物對(duì)及其應(yīng)用。首先，本專利技術(shù)的試劑盒和檢測(cè)方法不依賴于大型儀器而可通過(guò)肉眼直接進(jìn)行結(jié)果觀測(cè)，同時(shí)在溫和的條件(25-42℃)即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，檢測(cè)更方便。使用本專利技術(shù)的試劑盒和檢測(cè)方法可用于高效、快速地檢測(cè)/診斷呼吸道病原(例如甲型流感、乙型流感以及新冠狀病毒等)。其次，使用本專利技術(shù)的試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)多種呼吸道病原(例如甲型流感、乙型流感以及新冠狀病毒等)相互之間時(shí)無(wú)交叉反應(yīng)，且檢測(cè)的特異性和靈敏度均較高。目前沒(méi)有任何專利或文獻(xiàn)報(bào)道能夠完整的實(shí)現(xiàn)新型冠狀病毒、甲型流感、乙型流感的同時(shí)檢測(cè)，本申請(qǐng)首次提供了一種試劑盒和檢測(cè)方法等，其在保證靈敏度的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)對(duì)新冠、甲流和乙流的完整的、交互的特異性檢測(cè)。本專利技術(shù)的試劑盒和檢測(cè)方法可用于呼吸道病原的檢測(cè)與篩查，例如快速區(qū)分包括甲型流感(包括各種亞型)、乙型流感(包括各種亞型)以及新型冠狀病毒在內(nèi)的多種呼吸道病原。此外，目前所有基于CRISPR的檢測(cè)都是采用呼吸道樣品如咽拭子或鼻拭子，而本專利技術(shù)的試劑盒和檢測(cè)方法進(jìn)一步還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)除呼吸道樣品外其他類型樣品(例如肛拭子、糞便、痰液、痰液上清等分泌物)的檢測(cè)；同時(shí)可對(duì)活體組織來(lái)源的、含有多種病原的樣品中各個(gè)病原實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。首先，在設(shè)計(jì)檢測(cè)新型冠狀病毒和其他流感如甲型流感病毒和乙型流感病毒的crRNA和引物時(shí)，一方面需要考慮檢測(cè)新冠和其他流感時(shí)預(yù)防出現(xiàn)交叉反應(yīng)而出現(xiàn)誤診，另一方面由于新冠病毒自身的亞基因組結(jié)構(gòu)(subgenomicarchitecture)并未有明確的科學(xué)闡釋。目前研究表明，新冠病毒的亞基因組結(jié)構(gòu)由于含有10個(gè)不連續(xù)的編碼區(qū)而十分復(fù)雜，各個(gè)基因的表達(dá)情況以及各個(gè)基因片段對(duì)擴(kuò)增及CRISPR-Cas檢測(cè)的敏感性也不清楚；同時(shí)除了已知的10個(gè)編碼區(qū)還有其他未知的轉(zhuǎn)錄本。在設(shè)計(jì)引物時(shí)需要尋找出轉(zhuǎn)錄效率高的病原基因片段進(jìn)行設(shè)計(jì)(例如本專利技術(shù)人發(fā)現(xiàn)，同為新冠病毒基因，N基因比M基因更易獲得高效擴(kuò)增的引物(圖14和15)；還發(fā)現(xiàn)同為M基因，不同片段的擴(kuò)增效率差異很大(圖14))、設(shè)計(jì)crRNA時(shí)需要滿足Cas12aPAM序列的限制，同時(shí)還需要考慮必須定位于引物擴(kuò)增區(qū)域之內(nèi)，同時(shí)滿足這些要求的引物對(duì)和crRNA還需要能夠保證較高的靈敏度和特異性，還需要保證同時(shí)檢測(cè)新型冠狀病毒和其他流感如甲型流感病毒和乙型流感病毒時(shí)不發(fā)生交叉反應(yīng)，設(shè)計(jì)難度非常大。其次，特異性反映的是篩檢試驗(yàn)確定非陽(yáng)性樣本的能力；靈敏度是指某方法對(duì)單位濃度或單位量待測(cè)物質(zhì)變化所致的響應(yīng)量變化程度；在設(shè)計(jì)crRNA和引物對(duì)的過(guò)程中，需要平衡特異性和靈敏度的關(guān)系，眾所周知本領(lǐng)域中同時(shí)提高敏感度和特異度的難度非常大。在保證高特異性的同時(shí)靈敏度就會(huì)有所下降，在保證靈敏度高的同時(shí)特異性就會(huì)下降。本專利技術(shù)所要保護(hù)的試劑盒中檢測(cè)不同的病毒時(shí)，不僅能夠保證特異性的同時(shí)，而且還能夠保證很高的靈敏度。此外，目前所有的基于CRISPR的檢測(cè)都是采用咽拭子等呼吸道本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種crRNA，其特征在于，所述crRNA為檢測(cè)呼吸道病原的核酸的crRNA，所述呼吸道病原為新型冠狀病毒、甲型流感病毒和/或乙型流感病毒；其中；/n檢測(cè)所述新型冠狀病毒的crRNA的序列如SEQ ID NO:29-40、42、43、45-48中的一種或多種所示；/n檢測(cè)所述甲型流感病毒的crRNA的序列如SEQ ID NO:50-52中的一種或多種所示；/n檢測(cè)所述乙型流感病毒的crRNA的序列如SEQ ID NO:53-56中的一種或多種所示；/n所述crRNA優(yōu)選用于CRISPR-Cas檢測(cè)體系。/n
【技術(shù)特征摘要】
1.一種crRNA，其特征在于，所述crRNA為檢測(cè)呼吸道病原的核酸的crRNA，所述呼吸道病原為新型冠狀病毒、甲型流感病毒和/或乙型流感病毒；其中；
檢測(cè)所述新型冠狀病毒的crRNA的序列如SEQIDNO:29-40、42、43、45-48中的一種或多種所示；
檢測(cè)所述甲型流感病毒的crRNA的序列如SEQIDNO:50-52中的一種或多種所示；
檢測(cè)所述乙型流感病毒的crRNA的序列如SEQIDNO:53-56中的一種或多種所示；
所述crRNA優(yōu)選用于CRISPR-Cas檢測(cè)體系。
2.一種擴(kuò)增呼吸道病原的核酸的引物對(duì)，所述呼吸道病原為新型冠狀病毒、甲型流感病毒和/或乙型流感病毒；其中，
擴(kuò)增所述新型冠狀病毒的引物對(duì)的核苷酸序列如SEQIDNO:58-97中的一種或多種所示；
擴(kuò)增所述甲型流感病毒的引物對(duì)的核苷酸序列如SEQIDNO:98和SEQIDNO.99所示；
擴(kuò)增所述乙型流感病毒的引物對(duì)的核苷酸序列如SEQIDNO:100和SEQIDNO.101所示；
所述引物對(duì)優(yōu)選用于QPCR、LAMP或RPA中以擴(kuò)增所述核酸。
3.一種用于檢測(cè)呼吸道病原的核酸的試劑盒，其特征在于，其包括CRISPR-Cas檢測(cè)體系，所述CRISPR-Cas檢測(cè)體系包括：crRNA、Cas蛋白和核酸探針；其中，所述crRNA如權(quán)利要求1所述；
較佳地：
所述試劑盒還包括擴(kuò)增所述核酸的引物對(duì)；其中，擴(kuò)增新型冠狀病毒的引物對(duì)的核苷酸序列優(yōu)選如SEQIDNO:58-97中的一種或多種所示；和/或，擴(kuò)增甲型流感病毒的引物對(duì)的核苷酸序列優(yōu)選如SEQIDNO:98和SEQIDNO.99所示；和/或，擴(kuò)增乙型流感病毒的引物對(duì)的核苷酸序列優(yōu)選如SEQIDNO:100和SEQIDNO.101所示，所述的引物對(duì)優(yōu)選用于QPCR、LAMP或RPA中以擴(kuò)增所述核酸；
和/或，所述CRISPR-Cas檢測(cè)體系還包括金屬離子和/或緩沖液；
和/或，所述Cas蛋白包括Cas9、Cas12a、Cas12b和/或Cas13；
和/或，所述Cas蛋白的含量為100ng；
和/或，所述試劑盒的檢測(cè)樣品為痰液、痰液上清、鼻拭子、咽拭子、肛拭子和/或糞便。
4.一種用于檢測(cè)呼吸道病原的核酸的試劑盒，其特征在于，其包括如權(quán)利要求2所述的擴(kuò)增呼吸...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉佳，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上?？萍即髮W(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：上海;31
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