本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種新型冠狀病毒檢測試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法。本發(fā)明專利技術(shù)應(yīng)用新型冠狀病毒(SARS?CoV?2)同科的雞傳染性支氣管炎病毒作為新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。目前新冠檢測試劑盒質(zhì)量層次不齊，且陽性質(zhì)控均為質(zhì)粒樣品(DNA)，無法對病毒反轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)行監(jiān)督與評估。同時由于臨床樣品的多樣性與復(fù)雜性，也造成檢測結(jié)果的不穩(wěn)定性。本發(fā)明專利技術(shù)涉及質(zhì)控品可以在新型冠狀病毒檢測試劑盒研制、出廠檢驗及保存期監(jiān)測過程中提供靈敏度、特異性評價支持，有效監(jiān)控生產(chǎn)過程中各種因素對于試劑盒質(zhì)量的影響，同時用于評價樣品保存液對病毒的滅活效果，既保證樣品中病毒徹底滅活，也保證病毒核酸的有效保存，延長核酸的保存時間，確保檢測靈敏度。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種用于新型冠狀病毒檢測試劑盒的質(zhì)控品及其制備方法
本專利技術(shù)涉及病毒檢測試劑盒質(zhì)控
，特別涉及新型冠狀病毒(2019-nCoV)熒光定量檢測試劑盒質(zhì)控品的制備方法。
技術(shù)介紹
2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)被發(fā)現(xiàn)，2020年2月11日，國際病毒分類委員會(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV)正式將新型冠狀病毒(2019-nCoV)命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，SARS-CoV-2)。人感染了新冠狀病毒后常伴有呼吸困難、發(fā)熱、咳嗽和氣促等癥狀。在較嚴(yán)重病例中，感染可導(dǎo)致肺炎、嚴(yán)重急性呼吸綜合征、腎衰竭，甚至死亡。針對于當(dāng)前流行的2019新型冠狀病毒研發(fā)出快速、準(zhǔn)確的檢測方法是重要的，熒光定量RT-qPCR方法通常在1小時內(nèi)即可完成核酸樣本的檢測。然而，在試劑盒研發(fā)過程中常常會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。假陰性不但會造成對個體的錯誤判斷，延誤病情，更有可能造成傳染源的遺漏，造成嚴(yán)重影響。因此，如何最大程度避免檢測結(jié)果的假陰性出現(xiàn)，選擇何種標(biāo)準(zhǔn)品對試劑盒進(jìn)行質(zhì)量控制成為迫切需要解決的問題。研究表明，雞傳染性支氣管炎病毒(InfectiousBronchitisVirus，IBV)與2019新型冠狀病毒同屬于冠狀病毒科成員，其基因組均為線性的單股正鏈RNA病毒，5’末端具有甲基化的帽子結(jié)構(gòu)，3’末端具有polyA尾。冠狀病毒基因組全長在27～32kb之間，病毒基因組包含6～12個開放閱讀框，在所有冠狀病毒基因組中，編碼復(fù)制酶多聚蛋白以及4種結(jié)構(gòu)蛋白的基因排列次序均相同，即5′-ORF1ab-S-E-M-N-3′，編碼輔助蛋白的基因散落在結(jié)構(gòu)蛋白基因之間。雞傳染性支氣管炎病毒與2019新型冠狀病毒的理化特性幾乎相同，研究表明兩者均對溫度、pH值敏感。同時，對70％乙醇、甲醛、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑和消毒劑也均敏感(表1)。表明雞傳染性支氣管炎病毒為2019新型冠狀病毒熒光定量試劑盒研發(fā)過程中理想的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。可有效控制檢測試劑盒的特異性、靈敏性、精密性和穩(wěn)定性等。表1雞傳染性支氣管炎病毒與2019新型冠狀病毒的生物學(xué)特性比較
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)檢測試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法。本專利技術(shù)技術(shù)方案：1.本專利技術(shù)所述一種用于新型冠狀病毒檢測試劑盒的質(zhì)控品，其特征在于，該試劑盒選用雞傳染性支氣管病毒(QXL87株)作為新型冠狀病毒檢測試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品：所述的雞傳染性支氣管病毒(Infectionbronchitisvirus，IBV)為為QX型的IBVQXL87株，該毒株已于2018年09月13日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；保藏編號：CGMCCNo：16381。2.本專利技術(shù)所述一種用于新型冠狀病毒檢測試劑盒的質(zhì)控品，其特征在于該試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為：(1)選擇雞傳染性支氣管炎病毒QXL87株，進(jìn)行電子顯微鏡觀察，病毒S1基因測定分析；(2)對雞傳染性支氣管炎病毒QXL87株進(jìn)行傳代培養(yǎng)至病毒感染滴度穩(wěn)定，按照《中華人民共和國獸藥典》(2015版)方法，進(jìn)行病毒含量測定，作為濃縮純化以及試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量評價的賦值基點依據(jù)；(3)取病毒感染滴度在106.0EID50～107.0EID50以上的病毒液進(jìn)行3～5倍濃縮，并進(jìn)行純化處理；(4)按照《中華人民共和國獸藥典》(2015版)方法，對毒株進(jìn)行無菌、支原體、外源病毒的純凈性檢驗，確定純凈；(5)用含脫脂奶粉，蔗糖等凍干保護(hù)液，將濃縮純化后的目標(biāo)病毒懸液按1:1～1:1.5比例進(jìn)行稀釋混勻分裝，得到新型冠狀病毒檢測試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品半成品；(6)將得到的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品半成品進(jìn)行冷凍干燥處理，其中預(yù)凍階段：溫度為-12～-40℃，時間為1～2h；升華階段：溫度為-5℃～5℃，真空度為0.04～0.12bar，時間18～20h；解析階段：26～28℃，真空度為0.02～0.04bar最后得到質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的成品。3.本專利技術(shù)所述一種用于新型冠狀病毒檢測試劑盒的質(zhì)控品，其特征在于該試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)用是：(1)針對雞傳染性支氣管炎病毒QXL87株，設(shè)計特異性的引物及探針，優(yōu)化檢測條件，對樣品進(jìn)行熒光定量檢測；(2)將IBV作為陽性內(nèi)標(biāo)參照，加入到采集的新型冠狀病毒患者的咽拭子、鼻拭子、肺泡灌洗液、痰液、血液、血清等臨床樣品進(jìn)行檢測，評價臨床樣品中是否存在導(dǎo)致檢測假陰性抑制物，用于驗證新冠病毒核酸檢測試劑盒的檢測效果。本專利技術(shù)的積極意義本專利技術(shù)公開了一種新型冠狀病毒檢測試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法。應(yīng)用新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)同屬的雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)作為新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。本專利技術(shù)涉及IBV病毒質(zhì)控品的制備方法，通過雞胚接種對IBV病毒進(jìn)行傳代培養(yǎng)至病毒感染滴度穩(wěn)定，收獲病毒尿囊液，進(jìn)行濃縮、純化，測定病毒含量(EID50)，經(jīng)純凈性檢驗合格，加入保護(hù)劑，經(jīng)凍干得到試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。本專利技術(shù)涉及質(zhì)控品可以在新型冠狀病毒檢測試劑盒研制、出廠檢驗及保存期監(jiān)測過程中提供靈敏度、特異性評價支持，有效監(jiān)控由于原材料、人員操作、儀器狀態(tài)及試劑盒有效性等因素對于試劑盒質(zhì)量的影響，同時用于評價樣品保存液對病毒的滅活效果，既保證樣品中病毒徹底滅活，也保證病毒核酸的有效保存，延長核酸的保存時間，確保檢測靈敏度。本專利技術(shù)涉及的生物材料資源信息雞傳染性支氣管炎病毒(Infectionbronchitisvirus，IBV))QX型QXL87株來自揚(yáng)州大學(xué)，由中崇信諾生物科技泰州有限公司保存，并于2018年09月13日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保存；保藏編號：CGMCCNo：16381。附圖說明圖1S1基因電泳圖圖中顯示樣品1600bp目的基因片段。圖2不同新冠滅活樣品對IBV質(zhì)控測試溶解曲線圖中：2-1為咽拭子溶液，,2-2為鼻拭子溶液，2-3為肺泡灌洗液，2-4為痰液，2-5為血液，2-6為血清。圖3IBV質(zhì)控品與新冠陽性質(zhì)粒相關(guān)性圖中1為陽性質(zhì)粒CT，2為IBV質(zhì)控CT值。具體實施方式1.雞傳染性支氣管炎病毒(Infectionbronchitisvirus，IBV)為QX型的IBVQXL87株，該毒株已于2018年09月13日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；保藏編號：CGMCCNo：16381。2.取雞傳染性支氣管炎病毒QXL87株雞胚尿囊液，4℃8000r/min離心30min，取上清用2％磷鎢本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
1.本專利技術(shù)所述一種用于新型冠狀病毒檢測試劑盒的質(zhì)控品，其特征在于，該試劑盒選用雞傳染性支氣管病毒QXL87株作為新型冠狀病毒檢測試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品：/n所述的雞傳染性支氣管病毒(Infection bronchitis virus，IBV)為QX型的IBV QXL87株，該毒株已于2018年09月13日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；保藏編號：CGMCC No：16381。/n
【技術(shù)特征摘要】
1.本發(fā)明所述一種用于新型冠狀病毒檢測試劑盒的質(zhì)控品，其特征在于，該試劑盒選用雞傳染性支氣管病毒QXL87株作為新型冠狀病毒檢測試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品：
所述的雞傳染性支氣管病毒(Infectionbronchitisvirus，IBV)為QX型的IBVQXL87株，該毒株已于2018年09月13日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；保藏編號：CGMCCNo：16381。
2.如權(quán)利要求1所述一種用于新型冠狀病毒檢測試劑盒的質(zhì)控品，其特征在于該試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為：
(1)選擇雞傳染性支氣管炎病毒QXL87株，進(jìn)行電子顯微鏡觀察，病毒S1基因測定分析；
(2)對雞傳染性支氣管炎病毒QXL87株進(jìn)行傳代培養(yǎng)至病毒感染滴度穩(wěn)定，按照《中華人民共和國獸藥典》(2015版)方法，進(jìn)行病毒含量測定，作為濃縮純化以及試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量評價的賦值基點依據(jù)；
(3)取病毒感染滴度在106.0EID50-107.0EID50的病毒液進(jìn)行3～5倍濃縮，并進(jìn)行純化處理；<...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：何海蓉，刁小龍，陳啟穩(wěn)，王飛，張家銘，王秋娟，賈正，
申請(專利權(quán))人：中崇信諾生物科技泰州有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32
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