rhBACE的表達(dá)純化、活性測(cè)定方法及其在藥物篩選中的應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及重組人ｂｅｔａ－分泌酶（簡(jiǎn)稱ｒｈＢＡＣＥ）的制備及活性測(cè)定方法，由此建立了ｒｈＢＡＣＥ抑制劑篩選系統(tǒng)。本發(fā)明專利技術(shù)將ｐｒｏ－ｒｈＢＡＣＥ克隆到大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒ｐＥＴ２８ａ載體中，構(gòu)建ｐｒｏ－ｒｈＢＡＣＥ－ｐＥＴ２８ａ重組表達(dá)質(zhì)粒并在Ｅ．Ｃｏｌｉ　　Ｒｏｓｓｅｔａ中表達(dá)。包涵體中的表達(dá)產(chǎn)物溶于６ｍｏｌ／Ｌ鹽酸胍，經(jīng)Ｎｉ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ親和層析純化后，得到高純度的ｐｒｏ－ｒｈＢＡＣＥ蛋白。此蛋白在復(fù)性液中重新折疊后，于酸性條件（ｐＨ４．５）下激活，切去酶原序列，產(chǎn)生有活性的ｒｈＢＡＣＥ蛋白。本發(fā)明專利技術(shù)利用人工合成的熒光１７肽底物測(cè)定ｒｈＢＡＣＥ活性。本方法制備的ｒｈＢＡＣＥ可用于開(kāi)展對(duì)阿爾茨海默病發(fā)生機(jī)理的研究及抗阿爾茨海默病藥物的篩選。（*該技術(shù)在2024年保護(hù)過(guò)期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及人重組蛋白rhBACE，構(gòu)建的該蛋白的重組表達(dá)載體，由該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)菌。本專利技術(shù)涉及該重組蛋白的制備。包括其在大腸桿菌中的表達(dá)純化、復(fù)性方法、激活方法、及活性測(cè)定方法。本專利技術(shù)還涉及利用該蛋白和所述的活性測(cè)定方法進(jìn)行藥物篩選。
技術(shù)介紹
阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD，又稱早老性癡呆癥)是常發(fā)于老年人群中的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病.表現(xiàn)為失憶、失語(yǔ)、智能衰退和推理判斷能力喪失等癥狀。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，Aβ的沉積是AD病理的始發(fā)因素和中心環(huán)節(jié)。因此糾正Aβ的反常代謝，對(duì)抗Aβ的形成、沉積及毒性作用是治療AD的根本出路。決定Aβ代謝的關(guān)鍵酶成為治療AD很有潛力的靶點(diǎn)，為藥物治療AD開(kāi)辟了新的方向。Aβ是由β淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)水解產(chǎn)生的.正常的APP是一個(gè)膜結(jié)合蛋白.在病理狀態(tài)下，APP在二個(gè)蛋白水解酶的作用下，切下一個(gè)約40個(gè)氨基酸殘基的小肽，即Aβ.游離的Aβ在腦中堆積，形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)(Neurofibrillary Tangles)，使患者表現(xiàn)出阿爾茨海默病癥狀。直到近幾年才確定了水解APP生成A-beta的酶的身份，即-beta-分泌酶(beta-secretase).1999年，四個(gè)不同的制藥公司和一個(gè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室各自獨(dú)立報(bào)道了β分泌酶的確立，在這些報(bào)道中，β分泌酶被分別稱為β位點(diǎn)APP內(nèi)切酶(β-site APP cleaving enzyme，BACE)，BACE 1，ASP2和memapsin2。β分泌酶為501個(gè)氨基酸組成的跨膜天冬氨酸蛋白酶，包括一個(gè)接近羧基端的跨膜區(qū)、信號(hào)序列以及氨基端的前體蛋白區(qū)域。D 93和D 289兩個(gè)天冬氨酸是保持活性所必需的。BACE的基因位于第11號(hào)染色體，但導(dǎo)致FAD的基因突變并沒(méi)有發(fā)生在此基因上。BACE的mRNA在人類各種組織中均表達(dá)，在胰腺和大腦表達(dá)最高，神經(jīng)元BACEmRNA的水平較神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞高。BACE蛋白是N糖基化的，在胞膜可以檢測(cè)到，但主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中，不具有自我激活的能力。眾多研究結(jié)果表明，BACE對(duì)APP的酶切作用是Aβ形成的關(guān)鍵步驟.因此，BACE成為治療阿爾茨海默病的首選靶標(biāo).篩選BACE的抑制劑對(duì)于了解阿爾茨海默病的發(fā)病的分子機(jī)理，以及相應(yīng)的治療方法具有重要意義。目前，BACE的表達(dá)制備多在真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞等表達(dá)。真核細(xì)胞表達(dá)的缺點(diǎn)是產(chǎn)量低，不能滿足研究需要。對(duì)于抗早老性藥物的開(kāi)發(fā)，國(guó)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室在開(kāi)展BACE抑制劑的尋找。通常的研究程序制備BACE蛋白晶體，對(duì)其活性中心進(jìn)行X-衍射分析，然后根據(jù)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)原則設(shè)計(jì)BACE的活性中心抑制劑。這個(gè)研究程序費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)技術(shù)設(shè)備和科研人員的投入都比較高。截至目前為止，還沒(méi)有rhBACE表達(dá)純化、活性測(cè)定和抑制劑篩選等方面的研究報(bào)導(dǎo)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于制備有活性的人重組beta分泌酶蛋白(rhBACE)。將pro-rhBACE基因克隆到pET28a中，并在大腸桿菌中Rosseta中表達(dá)，利用pET28a提供的融合his-tag進(jìn)行親和純化。純化后的pro-rhBACE經(jīng)復(fù)性后在酸性條件下激發(fā)，變成有活性的rhBACE。本專利技術(shù)提供的rhBACE表達(dá)和純化方法和目前任何已報(bào)道的方法均不相同。本專利技術(shù)的另一目的在于提供人重組rhBACE基因的表達(dá)載體及該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)菌。本專利技術(shù)的又一個(gè)目的在于提供一個(gè)rhBACE活性測(cè)定方法，用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)rhBACE活性的抑制作用。本專利技術(shù)的再一個(gè)目的，在于建立一個(gè)藥物篩選平臺(tái)，用于高通量篩選針對(duì)rhBACE活性抑制的藥物，該篩選平臺(tái)也可以用于其它藥物的篩選。本專利技術(shù)的技術(shù)解決方案一種重組人beta-分泌酶蛋白的表達(dá)純化、活性測(cè)定方法，其特征在于a.克隆重組人beta-分泌酶蛋白基因，連接到質(zhì)粒表達(dá)載體中，利用大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物為beta-分泌酶蛋白；b.表達(dá)產(chǎn)物利用Ni-NTA親和柱進(jìn)行純化；c.純化產(chǎn)物經(jīng)激活后用熒光底物進(jìn)行活性測(cè)定。本專利技術(shù)方法包括重組人beta-分泌酶蛋白的全部或部分核苷酸序列及氨基酸序列。所述表達(dá)產(chǎn)物用Ni-NTA柱進(jìn)行親和純化，純化產(chǎn)物前重組人beta-分泌酶蛋白在pH4.5的酸性緩沖液中激活，形成有活性的重組人beta-分泌酶蛋白。本專利技術(shù)方法包括重組人beta-分泌酶蛋白利用熒光多肽底物進(jìn)行的活性測(cè)定方法，其中多肽底物序列為MCA-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Lys(DNP)-Arg-Arg-NH2。測(cè)量參數(shù)為激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為320.4nm和392.0nm。本專利技術(shù)方法抗早老性癡呆藥物篩選系統(tǒng)包括對(duì)噬菌體抗體庫(kù)的篩選，熒光多肽底物的使用，高通量熒光酶標(biāo)儀的使用。本專利技術(shù)制備有活性的人重組rhBACE蛋白，建立其活性測(cè)定方法，在此基礎(chǔ)上建立藥物篩選系統(tǒng)來(lái)篩選抗rhBACE的抑制藥物。本專利技術(shù)在大腸桿菌Rossata中表達(dá)BACE蛋白，由于包涵體的形成而大大地提高了表達(dá)量(超過(guò)20mg/L)。同時(shí)，本專利技術(shù)建立了相應(yīng)的激活方法，得到有活性的rhBACE。本專利技術(shù)利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，篩選能與BACE結(jié)合的噬菌體抗體，從中選取能抑制BACE活性的噬菌體抗體克隆。這一方法充分利用了噬菌體庫(kù)的高效篩選性能，大大加快了BACE抑制劑的獲得。附圖說(shuō)明圖1為pro-rhBACE的核苷酸序列。圖2為BACE的全長(zhǎng)蛋白序列、pro-rhBACE蛋白序列及rhBACE蛋白序列。圖上示出了BACE的信號(hào)肽序列、pro-rhBACE的起點(diǎn)、rhBACE的激活位點(diǎn)以及BACE蛋白的其它結(jié)構(gòu)特征。圖3為pro-rhBACE/pET28a的構(gòu)建過(guò)程圖。圖4為陽(yáng)性克隆的酶切鑒定示意圖。其中，泳道1rh-proBACE cDNA基因；泳道2pET28a用Nde I和Bpu1102I雙酶切大片段；泳道3pET28a-rh-proBACE用Nde I和Bpu1102 I的雙酶切片段。圖5為菌體裂解物及純化的rh-proBACE的SDS-PAGE示意圖。其中，泳道1非誘導(dǎo)；泳道23小時(shí)誘導(dǎo)后結(jié)果；泳道3Ni-Sepharose純化結(jié)果。圖6為不同條件處理下的rh-proBACE激活情況示意圖。其中，泳道1在pH7.9條件下，pro-rhBACE部分激活；泳道2在pH4.5條件下，pro-rhBACE全部激活。圖7為rhBACE的活性測(cè)定示意圖。根據(jù)本專利技術(shù)所述，提供含有圖1所述的DNA序列的人重組rhBACE基因。在本專利技術(shù)的一個(gè)實(shí)施例中，pro-rhBACE基因經(jīng)酶切后連接到pET28a中。構(gòu)建pro-rhBACE/pET28a表達(dá)載體。根據(jù)本專利技術(shù)的一個(gè)方面，提供包含rhBACE基因序列的重組載體。其中載體可以以質(zhì)粒、病毒顆粒以及噬菌體等形式。在本專利技術(shù)的一個(gè)實(shí)施例中，構(gòu)建了質(zhì)粒形式的載體。可通過(guò)多種方法將目的DNA插入到載體中，一般而言，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一些方法可以將本專利技術(shù)的DNA序列插入到一個(gè)適當(dāng)?shù)南拗菩悦竷?nèi)切位點(diǎn)上。表達(dá)載體中的DNA可操作地與一個(gè)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列(啟動(dòng)子)連接以指導(dǎo)蛋白合成，表達(dá)載體同時(shí)含有用于篩選轉(zhuǎn)化宿主細(xì)菌的表型性狀基因。用于構(gòu)建表達(dá)載體的質(zhì)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種重組人ｂｅｔａ－分泌酶蛋白的表達(dá)純化、活性測(cè)定方法，其特征在于：ａ．克隆重組人ｂｅｔａ－分泌酶蛋白基因，連接到質(zhì)粒表達(dá)載體中，利用大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物為ｂｅｔａ－分泌酶蛋白；ｂ．表達(dá)產(chǎn)物利用Ｎｉ－ＮＴＡ親和柱進(jìn)行純 化；ｃ．純化產(chǎn)物經(jīng)激活后用熒光底物進(jìn)行活性測(cè)定。

【技術(shù)特征摘要】
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉建寧，王石泉，郭志剛，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：南京大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：84[中國(guó)|南京]