診斷家畜血吸蟲病斑點金滲濾試劑盒其制備及應用方法技術

本發明專利技術提供了一種診斷家畜血吸蟲病斑點金滲濾試劑盒其制備及應用方法，屬新型的免疫標記技術和家畜血吸蟲病免疫學診斷技術。本發明專利技術將膠體金直接標記在日本血吸蟲抗原蛋白質上，適用于牛、羊、豬、兔等多種動物血吸蟲病抗體的檢測；在應用時僅需將被檢家畜血樣干紙浸出液，點在硝酸纖維素膜上作為固定相，再滴加血吸蟲抗原膠體金２～３滴（１００～１５０μｌ），２分鐘內即形成肉眼可見的紅色斑點，結果判斷容易，一個反應盒可做４份待檢血樣，降低了檢測成本，提高了效率，具有敏感、特異、檢出率高，省工、省時、成本低等優點。與糞孵血吸蟲毛蚴法相比，陽性符合率達１００％，陰性符合率９９．２％。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及家畜血吸蟲病的診斷
，尤其涉及家畜血吸蟲病斑點金免疫滲濾診斷試劑盒及其制備方法與應用方法。
技術介紹
家畜血吸蟲病既危害家畜健康，又是其病源的重要散播者。隨著我國血防工作的深入開展，雖已取得較大成績，但目前我國尚有100多個縣(市、區)未能控制該病傳播，同時在已基本消滅家畜血吸蟲病的省、地區也仍有長期鞏固與監測的任務。若采用常規糞孵血吸蟲毛蚴法檢測，需要投入較大的人力、物力和資金；現有的血清學診斷家畜血吸蟲病方法有IHA法、ELISA法，但其檢測時間長，單個樣品檢測需要0.5～3小時，而且這些方法中均含有潛在致癌物質的酶顯色底物。要完成國務院提出的“到2015年底，力爭全國所有未控制血吸蟲病流行的縣(市、區)達到血吸蟲病傳播控制標準”，急需有新的診斷技術支撐，因此尋找一種快速、簡便，適用于家畜血吸蟲病流行病學調查、普查、診斷、流通市場現場檢疫的方法，已成為防疫部門迫切希望解決的問題。目前，在診斷人血吸蟲病的方法中尚有金標法，丁建祖等浙江省醫學科學院寄生蟲病研究所快速檢測日本血吸蟲抗體的金標免疫滲濾法的建立及應用 中國寄生蟲病防治雜志 1998 11(4)308；沈麗英等浙江省醫學科學院寄生蟲病研究所 血吸蟲抗體金標免疫診斷試劑盒的研制 中國公共衛生2000 16(3)244；張素娥等 浙江省醫學科學院寄生蟲病研究所 金標抗rSjc26GST多克隆抗體斑點免疫金滲濾法檢測血吸蟲循環抗原的研究 中國血吸蟲病防治雜志 2000 12(5)265；干小仙等 浙江省醫學科學院寄生蟲病研究所 金標滲濾法快速檢測血吸蟲循環抗原的現場應用研究 中國人畜共患病雜志 2000 16(2)19該技術是將膠體金標記在兔抗人IgG或者兔抗血吸蟲蟲卵多抗或者GST-PcAb上作為探針和顯色劑，將血吸蟲可溶性蟲卵抗原或血吸蟲重組蛋白多抗包被在硝酸纖維素膜上作為捕捉抗體，組成雙夾心DIGFA(金標免疫滲濾法)。檢測時在測試盒的硝酸纖維素膜上滴加100μl待檢人血清，再用金標探針顯色的一種免疫學檢測方法。該法存在的主要問題是需要制備血吸蟲重組蛋白多抗或者兔抗人IgG或者兔抗血吸蟲蟲卵多抗或者GST-PcAb，制備這些專一多抗周期長，手續繁雜，成本很高，限制了它們在普查家畜血吸蟲病中推廣應用。而且在制備膠體金標記的探針時，通常以試管目測法確定多抗的用量，為了保證充分包被，避免多余膠體金與非特異蛋白結合而干擾檢測結果判斷，一般在此基礎上再增加10％～20％的多抗的用量，然后又為了去除多余的游離多抗，又需要進行層析或高速離心等純化處理，這些處理或者對設備條件要求很高，或者處理過程周期長，步驟繁雜，因此成本均高，不利于產業化開發；三是由于該法以捕捉多抗為固相，以待測血清和膠體金探針為流動相，所以一塊反應盒僅能檢測1個人的血樣，其檢測成本較高而效率較低；同時其含有包被抗原或多抗的硝酸纖維素膜的測試盒需在4～8℃的條件下貯藏，對大面積推廣應用增加了難度；四是反應步驟多，帶來的干擾也相對增多。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對上述不足之處，提供一種敏感、特異、結果可靠、成本低廉、檢測效率較高的家畜血吸蟲病診斷試劑盒；本專利技術的另一目的是提供該試劑盒中血吸蟲抗原膠體金的簡便、省本、省時的制備方法；本專利技術的第三個目的是提供一套應用該試劑盒對家畜血吸蟲病進行簡便，快速，準確的診斷方法。本專利技術斑點金免疫滲濾法的基本原理是一種采用硝酸纖維素膜為家畜待檢血樣的固相載體，以親和層析原理為基礎，抗原膠體金結合物為液相，并同時作為探針和指示劑，而建立起來的一種新型的免疫檢測方法。其中膠體金顆粒的表面帶負電荷與血吸蟲抗原蛋白分子的正電荷基團因靜電作用形成牢固的結合，同時金顆粒又有高電子密度的特性，當這些被標記的抗原與相應的抗體配體大量聚集時，便形成肉眼可見的紅色斑點。本專利技術的目的是通過下述技術方案予以實現的。一種診斷家畜血吸蟲病斑點金滲濾試劑盒，包括盒體、內置反應盒、黑色試劑瓶、生理鹽水瓶(內裝有0.85％生理鹽水)及玻璃毛細管(內徑1mm)及標準陽性血紙、陰性血紙；其中所述反應盒由盒底、盒蓋組成的塑料小盒，盒蓋中央有一直徑0.8cm的小圓孔，盒內裝滿吸水墊料，緊貼盒蓋小圓孔內放一層1.1×1.1cm硝酸纖維素膜(孔徑為0.45μ或0.65μ)，緊閉盒蓋即成反應盒；所述黑色試劑瓶內裝有血吸蟲抗原膠體金。一種制備上述診斷家畜血吸蟲病斑點金滲濾試劑盒的方法，所述盒體、黑色試劑瓶、生理鹽水瓶及玻璃毛細管均為常規實驗用品；所述黑色試劑瓶內裝有的血吸蟲抗原膠體金按以下原料比例與工藝步驟制備而成(1)、膠體金的制備 膠體金以1％氯金酸、1％檸檬酸三鈉、1％鞣酸、25mMK2CO3及雙蒸水為原料，先將1％氯金酸與雙蒸水按體積比1∶79配成A液；再將1％檸檬酸三鈉、1％鞣酸、25mMK2CO3與雙蒸水按體積比4∶0.03～0.15∶0.03～0.15∶15.70～15.94配成B液；將配制好的A液、B液在水浴內同時加熱到59～61℃，在電磁攪拌器上攪拌A液，快速加入B液，繼續攪拌1分鐘，在10～13分鐘內加熱至沸騰，氯金酸在鞣酸-檸檬酸鈉還原劑的作用下，使金離子還原成金原子，其液體顏色由黑→藍→紫→紅色，此時合成的膠體金顆粒直徑R＝8～12nm，較穩定，在4℃下可保存13個月。(2)血吸蟲可溶性抗原與純化抗原的制備 將日本血吸蟲卵置玻璃研磨器中研磨后，用0.85％NaCl溶液按重量配成5％濃度溶液，置-25℃反復凍融7次，用40KHz、400W超聲波探頭浸入溶液內處理20分鐘，在4℃下以13000rpm離心60分鐘，吸取上清液為血吸蟲可溶性抗原；將可溶性抗原經葡聚糖凝膠G200分離純化，將其中有活性的第I峰與II峰合并作為血吸蟲純化抗原；再將該可溶性抗原及純化抗原分別裝入透析袋，用雙蒸水進行透析去除鹽分后，即成合格的包被用的血吸蟲可溶性抗原與血吸蟲純化抗原。(3)膠體金pH值的調整 膠體金與血吸蟲抗原的結合在等電點的條件下最穩定，因此，膠體金液在被血吸蟲抗原包被前，需用0.25MK2CO3調整膠體金液的pH值為7.15～7.2，才能使膠體金與血吸蟲抗原牢固地結合。(4)血吸蟲抗原包被膠體金 按體積重量比每100ml膠體金液與血吸蟲可溶性抗原1.16～1.52mg或與血吸蟲純化抗原0.58～0.76mg混合進行包被，攪拌10分鐘后，依次加入適量的10％疊氮鈉、10％牛血清白蛋白和10％聚乙二醇，攪勻后1500rpm/min離心30分鐘，吸收紅色上清液，即成血吸蟲抗原膠體金，并按量分裝于黑色試劑瓶內封口，保存。上述血吸蟲抗原膠體金制備方法的一種優選方案是，其中所述配制膠體金的B液的組分與含量為1％檸檬酸三鈉4.0ml、1％鞣酸0.09ml、25mMK2CO30.09ml、雙蒸水15.82ml；制成的膠體金顆粒直徑為10＜D≤11nm；膠體金液pH值調為7.20；包被膠體金液的抗原采用血吸蟲可溶性抗原，膠體金液與抗原的體積重量比為100ml∶1.30mg。一種應用上述診斷家畜血吸蟲病斑點金滲濾試劑盒診斷家畜血吸蟲病的方法，具體是按以下步驟操作(1)待檢家畜干燥血紙血樣的采取 采取動物耳靜脈血2～5滴/頭，滴于紙面，陰涼干燥，備本文檔來自技高網...

【技術保護點】
診斷家畜血吸蟲病斑點金滲濾試劑盒，包括盒體、內置反應盒，黑色試劑瓶、生理鹽水瓶、玻璃毛細管及標準陽性血紙、陰性血紙，其特征是所述反應盒由盒底、盒蓋組成的塑料小盒，盒蓋中央有一直徑０．８ｃｍ圓孔，盒內裝滿吸水墊料、緊貼盒蓋圓孔內放一層１．１×１．１ｃｍ硝酸纖維素膜，緊閉盒蓋即成反應盒；所述黑色試劑瓶內裝有血吸蟲抗原膠體金。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張雪娟，盧福莊，方蘭勇，馮尚連，項美華，程菊芬，周永學，
申請(專利權)人：浙江省農業科學院，
類型：發明
國別省市：86[中國|杭州]