具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示序列的ＤＮＡ。（*該技術在2023年保護過期，可自由使用*）
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種與抑癌基因p53相關的一個新的具有激酶活性的基因，以及該基因編碼的蛋白質序列。本專利技術還涉及該基因在參與調控抑癌基因p53活性和制備防治腫瘤藥物、診斷試劑等方面的用途。
技術介紹
P53基因是腫瘤中突變頻率最高的抑癌基因，與人類50％的腫瘤有關。近年的研究表明它能引起細胞周期的阻滯，誘導凋亡和促進細胞終末分化，因此與腫瘤存在密切關系。人類P53蛋白存在兩種形式——野生型和突變型，兩者均參與調節細胞凋亡，前后對細胞增殖、轉化有抑制作用，故促進凋亡，而后者可激活前者的功能，抑制凋亡并導致細胞轉化和過渡增殖的危險。因此，調控P53功能的相關基因在腫瘤治療的過程中起著舉足輕重的作用。已有人進行了一些關于調控P53相關功能基因的研究，如mdm2通過對p53的蛋白質水平以及對p53的細胞內定位的影響從而調控p53的活性，但由于p53具體和哪些分子相互作用以及對細胞周期和細胞調亡的如何調控都還不甚清楚，所以尋找調控p53的基因在腫瘤治療和防治過程中有重要的意義。(見如下文獻Levine AJ.(1997).Cell，88，323-331；Kubbutat MH，Jones SN and Vousden KH(1997).Nature，387，299-303；Haupt YMaya R，Kazaz A and Oren M.(1997).Nature，387，296-299)。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種可調控抑癌基因p53的cDNA序列，以及該cDNA編碼的蛋白，并用其制備防治腫瘤藥物、診斷試劑。本專利技術發現具有SEQ ID NO1所示的cDNA序列(命名為SHIK)，該基因及其編碼的蛋白(具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列)能夠對抑癌基因p53進行調控，達到本專利技術的上述目的。本專利技術利用分子克隆及報告基因實驗的方法，獲取新基因SHIK，并對其進行了如下SHIK對抑癌基因p53調控機理的研究1.通過構建真核表達載體和磷酸鈣轉染的方法將含有該基因的真核表達質粒轉入人的胚腎293細胞系中，通過報告基因實驗發現該基因能夠顯著的抑制P53的轉錄活性。2.利用定點突變的方法，發現SHIK的突變體不僅不能抑制而且還能促進P53的轉錄活性，說明SHIK的激酶活性在調控P53的轉錄活性過程中起重要作用。從以上實驗結果判斷，本專利技術提供的SHIK基因可能是一種原癌基因，利用該基因的突變體，可以正調控p53，從而抑制腫瘤的發生。在腫瘤的臨床治療中可作為篩選小分子藥物靶標及診斷試劑。與各種藥物可接受的賦形劑、藥物輔劑配伍后，SHIK基因表達的蛋白可制成各種類型的藥物，用于預防或治療與腫瘤相關的疾病。附圖說明圖1是P53熒光報告基因檢測結果，在圖A中，橫坐標表示所加的基因(SHIK和P53)的DNA的量，縱坐標表示p53的轉錄活性，在圖B中，橫坐標表示所加基因(SHIK)的量，縱坐標表示IFN-γ的活性，在圖C中，橫坐標表示所加的基因(SHIK的突變體)的量，縱坐標表示p53的轉錄活性。具體實施例方式一.材料及方法材料人胚腎293細胞購自ATCC；細胞培養用DMEM，胎牛血清，0.05％胰酶溶液，丙酮酸鈉溶液，青、鏈酶素溶液購自GIBCO和Hyclone；哺乳動物細胞表達載體pRK-FLAG由本實驗室構建；p53熒光報告質粒由Dr.Bert Vegolstein(John Hopkins University)惠贈；pRL-SV40 Renilla熒光報告質粒購于Promega；大腸桿菌表達載體PET-28a，大腸桿菌BL21(DE3)菌株及鎳離子柱純化試劑盒購自Novagen；載體構建所需限制性內切酶購自Promega；DNA回收試劑盒Geneclean III Kit購自Q-BIO Gene； DNA序列測定由中國上海生工生物工程公司完成；PCR引物由中國上海生工生物工程公司合成；雙熒光報告基因檢測試劑盒購自Promega；Western blot用硝酸纖維素膜Hybond ECL和HRP偶聯的羊抗鼠IgG、羊抗鼠兔IgG購自Amersham pharmacia biotech.；化學發光底物試劑盒購自PIERCE；FLAG單克隆抗體購自Sigma；兔抗人SHIK蛋白的多克隆抗體由中科院遺傳所免疫室制備；TXRD偶聯的羊抗鼠IgG，FITC偶聯的羊抗兔IgG，DAPI購自Southern BiotechnologyAssociates Inc.；防淬滅封片劑Gel/mountTM購自Biomeda Corp.；CaCl2，PEG4000，LiAc，DMSO購自Sigma；CsCl購自Fisher Biotech.；β-gal購自Promega；其它化學試劑購自北京化學試劑商店。方法1.質粒構建及DNA純化GeneBank檢索及EST(expression sequence tag)序列拼接得到SHIK分子的全長編碼序列，根據這一序列分別設計5’端及3’端引物，通過PCR從B細胞cDNA文庫中克隆到SHIK全長分子，SalI/NotI或EcoRI/NotI酶切后分別插入哺乳動物細胞表達載體pRK-FLAG和大腸桿菌表達載體PET-28a中，得到哺乳動物細胞表達質粒pRK-FLAG-SHIK及大腸桿菌表達質粒PET-28a-SHIK。構建的哺乳動物細胞表達質粒均參照《分子克隆》(J.薩姆布魯克等，1999)質粒大量提取法，經CsCl密度梯度超速離心純化。2.細胞培養和細胞轉染人胚腎293細胞培養于含10％胎牛血清的高糖DMEM培養基中37℃5％二氧化碳培養箱培養。293細胞(1×105)接種于12孔板中，18小時后參照《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等，1999)進行磷酸鈣介導的轉染。3.熒光報告基因檢測293細胞(～1×105)接種于12孔板中，18小時后進行磷酸鈣介導的轉染。每個樣品設三個平行實驗組，適量加入空載體以保持每組轉染的DNA總量相等。每孔加入0.1μgp53熒光報告質粒；為了平衡轉染效率，同時加入0.1μg pRL-SV40-Renilla熒光報告質粒。轉染后14-18小時進行檢測，用Promega公司的熒光檢測試劑盒檢測p53熒光報告基因及pRL-SV40-Renilla熒光報告基因的活性，方法分別參照產品說明。4.重組蛋白的表達及純化將PET-28a-SHIK質粒轉化入大腸桿菌BL21-DE3，擴增培養至500ml，用1mM IPTG誘導5小時，參照先前的方法(李聯運等，2001)及Novagen鎳離子柱純化試劑盒說明進行SHIK重組蛋白的純化。5.免疫熒光染色將293細胞培養于載玻片上，用表達載體或相應的空載體進行轉染并培養20hrs；將細胞用冰預冷的甲醇和丙酮分別固定10mins。經PBS漂洗后，用0.1％TritionX-100 PBS浸3mins，分別用FLAG的單克隆抗體(Sigma)，兔抗人SHIK蛋白抗血清以及對照鼠IgG或兔免疫前血清于37℃溫育2hrs，經PBS漂洗后，再分別與TXRD偶聯的羊抗鼠IgG，FITC偶聯的羊抗兔IgG于37℃蔽光溫育1hr，經PBS漂洗后，加DAPI室溫作用5mins，Gel/Mount封片。Lecai DMR/XA(DMRB)熒光顯本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃俊，舒紅兵，翟中和，
申請(專利權)人：北京大學，
類型：發明
國別省市：
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