抗天冬氨酸特異半胱氨酸蛋白酶-8的抗體,其制備方法及應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及抗天冬氨酸特異半胱氨酸蛋白酶－８（ｃａｓｐａｓｅ－８）中特異性區(qū)域的抗體及其應(yīng)用。（*該技術(shù)在2022年保護(hù)過(guò)期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
,其制備方法及應(yīng)用的制作方法
本專利技術(shù)涉及抗天冬氨酸特異半胱氨酸蛋白酶(caspase-8)中特異性區(qū)域的抗體及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
腫瘤壞死因子(TNF-α)和淋巴毒素(TNF-β)是多功能促炎細(xì)胞因子，它們主要由單核白細(xì)胞形成，對(duì)細(xì)胞有多種作用(Wallach，D.(1986)，Interferon 7(IonGresser編輯)，83-122頁(yè)，Academic Press，London；Beutler和Cerami(1987))。TNF-α和TNF-β通過(guò)結(jié)合特異性細(xì)胞表面受體來(lái)啟動(dòng)其作用。其中一些作用可能對(duì)生物體有利它們可能會(huì)破壞例如腫瘤細(xì)胞或感染了病毒的細(xì)胞，并增強(qiáng)粒細(xì)胞的抗菌活性。通過(guò)這種方式，TNF對(duì)于保護(hù)生物體抵御腫瘤和感染性因子以及從損傷中恢復(fù)有貢獻(xiàn)。因此，TNF可用作抗腫瘤劑，其中它結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面上的受體，從而啟動(dòng)了導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的行為。TNF還可用作抗感染劑。然而，TNF-α有有害的作用。有證據(jù)顯示，過(guò)度產(chǎn)生TNF-α?xí)趲追N疾病中起主要致病作用。例如，已經(jīng)知道，TNF-α主要作用于脈管結(jié)構(gòu)，這是膿毒休克癥狀的主要病因(Tracey等，1986)。在一些疾病中，TNF可能會(huì)通過(guò)抑制脂肪細(xì)胞的活性和引起缺乏食欲而導(dǎo)致體重過(guò)度減輕(惡病質(zhì))，因此，TNF-α稱為惡病質(zhì)素。另外，它還被描述成是風(fēng)濕性疾病中組織損傷的一種介導(dǎo)劑(Beultler和Cerami，1987)，以及移植物抗宿主反應(yīng)中所見(jiàn)破壞的主要介導(dǎo)劑(Grau GE等人，1989)。此外，已知TNF參與發(fā)炎過(guò)程和其它許多疾病。兩種不同的獨(dú)立表達(dá)的受體p55(CD120a)和p75(CD120b)TNF受體與TNF-α和TNF-β特異性結(jié)合，它們啟動(dòng)和/或介導(dǎo)了TNF的上述生物學(xué)效應(yīng)。這兩種受體在結(jié)構(gòu)上有不相似的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，這暗示它們的信號(hào)傳導(dǎo)方式不同(參見(jiàn)Hohmann等，1989；Engelmann等，1990；Brockhaus等，1990；Loestscher等，1990；Schall等，1990；Nophar等，1990；Smith等，1990)。然而，例如涉及CD120a和CD120b胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的各種蛋白和可能存在的其它因子的細(xì)胞機(jī)制尚未得到闡明。該胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)通常在配體(即TNF-α或β)結(jié)合受體后發(fā)生，正是該胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)致使級(jí)聯(lián)反應(yīng)開(kāi)始并最終導(dǎo)致所見(jiàn)的細(xì)胞對(duì)TNF的反應(yīng)。關(guān)于上述TNF的殺細(xì)胞作用，就目前研究的大多數(shù)細(xì)胞而言，該作用主要由CD120a引發(fā)。抗CD120a胞外結(jié)構(gòu)域(配體結(jié)合域)的抗體本身能引發(fā)殺細(xì)胞效應(yīng)(見(jiàn)EP 412486)，該效應(yīng)與受體交聯(lián)抗體的效率相關(guān)，認(rèn)為這是胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程產(chǎn)生的第一步。而且，誘變研究(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993)已經(jīng)表明，CD120a的生物功能取決于其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的完整性，因而提出導(dǎo)致TNF殺細(xì)胞效應(yīng)的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)啟動(dòng)的發(fā)生是CD120a的兩個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域締合的結(jié)果。而且，TNF(α和β)形成均三聚體，因此，已提出通過(guò)CD120a靠其結(jié)合和交聯(lián)受體分子即引起受體聚集的能力來(lái)誘導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)(Engelmann H等，1990)。TNF/NGF受體超家族的另一個(gè)成員是FAS/APO1受體(CD95)。CD95以凋亡方式介導(dǎo)細(xì)胞死亡(Itoh等，1991)，并且好象是自身反應(yīng)T細(xì)胞的陰性選擇物，即在T細(xì)胞成熟期間，CD95介導(dǎo)了識(shí)別自身抗原的T細(xì)胞的凋亡性死亡。還發(fā)現(xiàn)，CD95基因(lpr)中的突變?cè)谛∈笠鹆伺c人自身免疫疾病全身性紅斑狼瘡(SLE)相似的淋巴細(xì)胞增生疾病(Watanable-Fukunaga等，1992)。CD95的配體是其它細(xì)胞中殺傷T細(xì)胞(或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞-CTL)中攜帶的細(xì)胞表面相關(guān)分子，因此，當(dāng)該CTL接觸攜帶CD95的細(xì)胞時(shí)，它們能誘導(dǎo)攜帶CD95的細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡。另外，已經(jīng)制得對(duì)CD95有特異性的單克隆抗體，該單克隆抗體能誘導(dǎo)攜帶CD95的細(xì)胞，包括被編碼人CD95的cDNA轉(zhuǎn)化的小鼠細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡(Itoh等，1991)。Wallach等(1999)對(duì)TNF受體與包括不同受體的Fas信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制、它們的調(diào)節(jié)及下游已鑒定的信號(hào)傳導(dǎo)分子作了詳細(xì)綜述。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些惡性細(xì)胞和HIV感染的細(xì)胞在其表面攜帶了CD95，因此可利用抗CD95的抗體或CD95配體來(lái)引發(fā)這細(xì)胞中的CD95介導(dǎo)的胞毒作用，從而提供一種抵抗這些惡性細(xì)胞或HIV感染的細(xì)胞的方法(見(jiàn)Itoh等，1991)。因此，尋求其它方法來(lái)增強(qiáng)CD95胞毒活性可能也會(huì)有治療潛力。提供一種調(diào)節(jié)對(duì)TNF(α或β)和CD95配體的細(xì)胞反應(yīng)的方法是人們長(zhǎng)期以來(lái)的需求。例如，在上述病理場(chǎng)合下，當(dāng)TNF或CD95配體過(guò)度表達(dá)時(shí)，就需要抑制TNF或CD95配體誘導(dǎo)的殺細(xì)胞效應(yīng)，而在其它場(chǎng)合，例如傷口愈合的應(yīng)用中，則希望增強(qiáng)TNF的效應(yīng)，或在CD95的情況下，在腫瘤細(xì)胞或HIV感染的細(xì)胞中，希望增強(qiáng)CD95介導(dǎo)的效應(yīng)。申請(qǐng)人已經(jīng)用了很多方法(例如參見(jiàn)歐洲專利申請(qǐng)No.EP 186833，EP 308378，EP 398327和EP 412486)來(lái)調(diào)節(jié)TNF的有害作用，方法是用抗TNF抗體或可溶性TNF受體(基本上是此受體的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域)抑制TNF與其受體結(jié)合，以和TNF與細(xì)胞表面結(jié)合的TNF受體(TNF-Rs)結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)。另外，由于TNF與其受體的結(jié)合是TNF誘導(dǎo)細(xì)胞效應(yīng)所需的，因此申請(qǐng)人已經(jīng)設(shè)法通過(guò)調(diào)節(jié)TNF-Rs的活性來(lái)調(diào)節(jié)TNF的作用(例如參見(jiàn)EP 568925)。EP 568925涉及一種調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或TNF-Rs中斷裂的方法，從而肽或其它分子可與受體本身或與該受體相互作用的效應(yīng)蛋白相互作用，從而調(diào)節(jié)了TNF-Rs的正常功能。EP 568925描述了在CD120a的胞外、跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中有突變的各種CD120a突變體的構(gòu)建和性質(zhì)分析。這樣，CD120a的上述結(jié)構(gòu)域內(nèi)的區(qū)域被確定為受體發(fā)揮功能，即與配體(TNF)結(jié)合以及隨后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，最終導(dǎo)致所見(jiàn)的TNF對(duì)細(xì)胞的效應(yīng)所必需的。而且，該文還描述了許多分離和鑒定蛋白、肽或其它因子的方法，這些蛋白、肽或其它因子能結(jié)合CD120a上述結(jié)構(gòu)域內(nèi)的不同區(qū)域，可能參與了TNF-Rs活性的調(diào)節(jié)或調(diào)控。在EPO 368925中還描述了分離和克隆編碼這些蛋白和肽的DNA序列的方法；構(gòu)建表達(dá)載體來(lái)產(chǎn)生這些蛋白和肽的方法；以及與CD120a或與結(jié)合CD120a不同區(qū)域的上述蛋白和肽相互作用的抗體或其片段的制備方法。然而，EP 568925沒(méi)有指明結(jié)合TNF-Rs胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的實(shí)際蛋白和肽。同樣，EP 568925也沒(méi)有公開(kāi)能結(jié)合CD95胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的蛋白或多肽。因此，當(dāng)希望抑制TNF或CD95配體的作用時(shí)，需要減少細(xì)胞表面的TNF-Rs或CD95的數(shù)量或活性，而當(dāng)需要增強(qiáng)TNF或CD95配體的作用時(shí)，希望增加TNF-Rs或CD95的數(shù)量或活性。出于這一目的，已經(jīng)對(duì)CD120a和CD120b的啟動(dòng)子進(jìn)行了測(cè)序和分析，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多對(duì)不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子有特異性的一些關(guān)鍵序列基序，因此可以在其啟動(dòng)子水平上來(lái)控制這些TNF-Rs的表達(dá)，即通過(guò)抑制啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄來(lái)減少受體數(shù)量，增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種通過(guò)用天冬氨酸特異半胱氨酸蛋白酶－８（ｃａｓｐａｓｅ－８）Ｓｕｂ－１亞基Ｃ末端的肽及其片段免疫動(dòng)物而得到的抗體，其特征在于：所述抗體能夠共免疫沉淀所述的ｃａｓｐａｓｅ（活性ｃａｓｐａｓｅ－８和ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－８）與ｃａｓｐａｓｅ結(jié)合蛋白，而且能夠在洗脫后自免疫復(fù)合物中有效地釋放出ｃａｓｐａｓｅ和ｃａｓｐａｓｅ結(jié)合蛋白。

【技術(shù)特征摘要】
...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：D沃勒克，T岡察洛夫，G克魯馬姆，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：耶達(dá)研究發(fā)展有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：IL[以色列]