一種用于Ｈｐ菌患者血清抗體快速診斷的試劑盒產品，其特征在于：該試劑盒以幽門螺桿菌尿素酶為抗原，基于膜免疫層析的原理，采用膠體金雙抗原夾心法來制備。（*該技術在2023年保護過期，可自由使用*）
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及用膠體金雙抗原夾心法制備的幽門螺桿菌尿素酶血清抗體快速診斷試劑盒。現有技術幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是慢性胃炎、消化性潰瘍的重要致病因子，在胃癌的癌變模式中也起著先導作用，胃癌的發生與幽門螺桿菌感染的時間長短具有直接關系。1994年，世界衛生組織國際癌癥研究機構正式將幽門螺桿菌列為I類(即肯定的)致癌源。我國人群Hp菌感染率高達50％左右，每年有1200萬的新增感染人群。以往診斷Hp感染常用胃粘膜組織病理學檢查、胃粘膜組織Hp菌培養和采用13C、14C呼吸試驗以及14N排泄試驗。病理組織學檢查及細菌培養除要求較高的試驗條件外，尚要以接受胃鏡檢查為前提，不能被廣泛應用，復查時更不易被病人接受；呼吸試驗和尿素排泄試驗雖具有靈敏和特異的特點，但因價格昂貴，不利于臨床上推廣普及。二十世紀八十年代末，國內建立了Hp血清抗體檢測方法，但因采用Hp全菌抗原、Hp全菌超聲破碎抗原、酸提取抗原和高分子量相關抗原等，明顯存在因交叉反應所造成的假陽性和因菌株間抗原性差異而造成的假陰性，可靠性較差，以致某些臨床單位出現對胃炎及消化性潰瘍病人不經進一步診斷而盲目開展抗Hp菌治療的趨勢。二十世紀九十年代，中國預防醫學科學院流行病學微生物學研究所專利技術了人血清抗幽門螺桿菌尿素酶抗體體外檢測試劑盒(申請號95108003.2，公開號CN1140257A)，該專利技術采用酶聯免疫法，用Hp尿素酶抗原包被酶標反應板，其酶標抗體為HRP-SPA。該方法雖在一定程度上彌補了過去Hp血清抗體檢測方法的缺陷，但仍存在一些出于該方法本身的缺陷，而無法解決的問題，如只能檢測血清中的IgG抗體、時間長(2-3小時)、步驟多(2-3步)、需特殊儀器(酶聯檢測儀)、保存時間短(3個月)、須同時操作多人份血清、病人獲得檢測結果時間長等。本專利技術旨在為臨床診斷Hp感染、開展抗Hp感染治療的隨訪以及Hp感染的流行病學調查提供一種靈敏、快速、特異的診斷試劑盒。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供用于Hp菌患者血清抗體快速診斷的試劑盒產品，該試劑盒以幽門螺桿菌尿素酶為抗原，基于膜免疫層析的原理，采用膠體金雙抗原夾心法來制備。該試劑盒包括粘貼于檢測板條上的檢測膜，試劑墊和吸收墊，其特征在于檢測膜上包被有Hp菌尿素酶抗原、試劑墊包被了膠體金標記的Hp菌尿素酶抗原。該產品可同時檢測血清中IgG、IgM型抗體和唾液等分泌物中的IgA型抗體；具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、無需專用的儀器和設備、結果直觀等特點。本專利技術的另一個目的是提供上述試劑盒的制備方法，包括A、Hp菌尿素酶抗原的制備；B、噴膜，將抗原噴涂到硝酸纖維素膜上；C、標記，用膠體金標記抗原；D、組裝，在檢測板條上組裝檢測膜、試劑墊、吸收墊；E、切條，用切條機切成小條；F、成品，將小條放入扣盒中，并密封。本專利技術的實施方式(一)、Hp尿素酶抗原的制備細菌培養將Hp菌株接種于含10％脫纖維羊血的布氏瓊脂平皿中置混合氣體(5％氧氣，10％二氧化碳，85％氮氣)環境中，37℃培養三天后收菌。細菌破碎及預處理將收集的Hp菌用生理鹽水洗滌一遍后，用凝膠過濾洗脫液(0.05M Tris-Cl，pH0.8，含0.005％的硫柳汞)將菌稀釋至適當濃度(約14億菌/ml)，經超聲破碎(在冰浴下進行)后，高速離心(12000rpm，30’)后取上清備用。凝膠過濾過程及洗脫峰尿素酶活性檢測凝膠過濾介質選用Sephacryl S 300(Amerson-Pharmacia公司產品)，柱型2.6×75cm，抗原上柱體積15-30ml，洗脫液為0.05M Tris-Cl，pH8.0，洗脫速度為16滴/分鐘，收集、檢測及記錄自動進行，每管收集50滴，每隔5管測定一次尿素酶活性，尿素酶試劑由本公司配制。尿素酶提純效果分析將凝膠過濾后尿素酶活性峰成分進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)觀察尿素酶提純效果。SDS-PAGE按參考文獻進行，濃縮膠采用5％濃度，分離膠采用11％濃度，電泳采用Tris-甘氨酸緩沖系統，凝膠經考馬斯亮蘭R-250染色，收集高純度部分備用。純化尿素酶成分抗原性Western-blot分析將純化的尿素酶成分，經SDS-PAGE電泳后，將各蛋白轉移到硝酸纖維素膜(簡稱NC膜)上，NC膜經5％脫脂奶粉封閉過夜后，放入1∶50稀釋的兔抗Hp抗血清中，室溫震蕩2小時，用0.05％Tween20-TBS洗NC膜三次后，浸泡NC膜于1∶200稀釋的辣根過氧化物酶標記的葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)中，室溫振蕩2小時，用Tween20-TBS洗NC膜三次后，用底物顯色液(6mg 4-氯-1-萘酚溶于2ml冷甲醇，與含6ul 30％H2O2的10ml TBS混合)浸泡待檢NC膜，室溫震蕩10-30分鐘，觀察其抗原性，將抗原性良好的尿素酶成分用于試劑盒用抗原。純化后的抗原保存于-20℃以下。(二)檢測膜的噴涂與處理將硝酸纖維素膜(孔徑為8um)平放于BioDot X-Y噴涂儀上。將純化的尿素酶抗原用PBS稀釋為1mg/ml，加入試劑瓶中。設程序為尿素酶噴涂程序(生物噴頭，線狀，角度0，速度50cm/秒，頻率150Hz，開放時間4％，X0＝0，Y0＝3.5mm，長度30mm，高度2mm，壓力4psi)，噴涂。將膜置于室溫晾干后放入干燥箱待用。(三)、膠體金的制備和標記采用枸櫞酸三鈉還原法制備膠體金。取750ml去離子水在快速磁力攪拌條件下加熱至95℃。加入7ml 1％的四氯化金溶液，繼續在快速攪拌中煮沸5分鐘。而后，加入8.4ml的1％的枸櫞酸鈉溶液，并在劇烈攪拌中煮沸5分鐘。將經枸櫞酸鈉還原的四氯化金(膠體金)溶液移至冷水中，快速攪拌中冷卻30分鐘。用分光光度計分別測定溶液在波長540nm的吸光值。OD540必須在0.9-1.2之間。用100mM的碳酸鉀溶液將上步所獲的膠體金溶液的pH調至6.5。取250ul膠體金溶液，加入1mg/ml的尿素酶抗原1ul，混勻后加入27.5ul 10％NaCl并觀察顏色反應。遇有顏色變紫，則加大尿素酶抗原用量至不再出現顏色反應為止。按照試驗所得尿素酶標記量，計算出所標記液體的尿素酶總需求量。在快速攪拌的條件下加入尿素酶溶液。在室溫下攪拌30分鐘后加入2％的牛血清白蛋白，并繼續在室溫下攪拌15分鐘。而后，將溶液置于4℃下離心1小時，離心力為10000g。小心棄去上清，盡量避免攪動沉淀物。加入42ml 100mM Na2HPO4，pH7.4，其中含2％牛血清白蛋白。重新懸浮沉淀物后，在4℃離心20分鐘，離心力10000g。棄去上清，保留沉淀物。用42ml含2％牛血清白蛋白的10mM的Na2HPO4重新懸浮沉淀物。用0.22μm的硝酸纖維膜過濾除菌后存放于4℃，備用。(四)、試劑墊的制備試劑墊(玻璃纖維膜)是檢測板條上存留膠體金標記尿素酶試劑的部位，將制備好的膠體金溶液均勻噴涂在試劑墊上，晾干后切成30×1.4cm的窄條備用。(五)、檢測板條的制作取具有粘性表面的8×30cm塑料薄板，將檢測膜貼于距薄板頂端3cm處。然后在檢測膜上端貼一3×30cm的厚濾紙條構成吸收墊，在檢測膜下端貼試劑墊。試劑墊下端貼無膠體金標記尿素酶的玻璃纖維，各條之間重疊1mm，制作好的長本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：馬運國，
申請(專利權)人：深圳市康美實業發展有限公司，
類型：發明
國別省市：
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