一種以酶聯(lián)免疫方式檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子活性的方法技術(shù)

一種以酶聯(lián)免疫方式檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子活性的方法，其步驟如下： （１）合成二條與相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的單鏈ＤＮＡ序列，然后，進(jìn)行退火，復(fù)性，形成ＤＮＡ雙鏈，再用核酸檢測(cè)儀進(jìn)行定量，并在４℃條件下真空干燥； （２）利用核酸粘附液，將上述雙鏈ＤＮＡ配成５～２０ｐｍｏｌ／μｌ濃度，然后加入酶聯(lián)板的板孔中，每孔１００～２００μｌ，室溫反應(yīng)１～２小時(shí)后，將包被液倒出，用ＰＢＳ緩沖液洗滌，將未結(jié)合的雙鏈ＤＮＡ及粘附液充分洗滌掉，晾干備用； （３）每孔加入５０～１００μｌ、含量為２～２０μｇ細(xì)胞或組織提取蛋白，在３７℃條件下，反應(yīng)１小時(shí)，倒掉液體，用ＰＢＳ緩沖液洗滌，將未結(jié)合的蛋白充分洗滌掉； （４）將針對(duì)相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的單克隆抗體用抗體稀釋液稀釋成濃度為１∶１０００～２０００，然后每孔加入１００～２００μｌ，在３７℃條件下，反應(yīng)１小時(shí)，倒掉液體，用ＰＢＳ緩沖液洗滌，將未結(jié)合的抗體洗滌掉； （５）將ＨＲＰ（辣根過(guò)氧（化）物酶）標(biāo)記的ＩｇＧ抗體用抗體稀釋液稀釋成濃度為１∶１０００～２０００，然后每孔加入１００～２００μｌ，在３７℃條件下，反應(yīng)１小時(shí)，倒掉液體，用ＰＢＳ緩沖液洗滌，將未結(jié)合的抗體洗滌掉； （６）每孔加入１００～２００μｌ顯色液，在３７℃條件下，反應(yīng)２～２０分鐘； （７）每孔加入１００μｌ反應(yīng)終止液； （８）用酶鏈免疫檢測(cè)儀測(cè)定在波長(zhǎng)為４５０ｎｍ或４９０ｎｍ，參考波長(zhǎng)６５５ｎｍ時(shí)的吸光度值，一般要求５分鐘內(nèi)測(cè)完。（*該技術(shù)在2023年保護(hù)過(guò)期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種生物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法，特別是一種檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子活性的方法。(二)、技術(shù)背景核轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor)是一種DNA結(jié)合蛋白，對(duì)多種基因的表達(dá)有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)作用。現(xiàn)有研究較多的核轉(zhuǎn)錄因子有核因子-κB(nuclear factorκB，NF-κB)、AP-1(c-Fos，F(xiàn)osB，和c-Jun)、CREB等。它們一般由二個(gè)不同功能的結(jié)構(gòu)域組成，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Binding domain，BD)和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(Activationdomain，AD)組成，前者主要負(fù)責(zé)與特異的DNA序列結(jié)合，后者具有轉(zhuǎn)錄激活活性，通過(guò)調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)來(lái)參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究表明，核轉(zhuǎn)錄因子與多種細(xì)胞功能(如細(xì)胞的增殖、分化等)、免疫調(diào)節(jié)、應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，是近年來(lái)上述領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。越來(lái)越多的證據(jù)表明核轉(zhuǎn)錄因子活性的變化能明顯反應(yīng)細(xì)胞、組織的病理生理功能改變以及一些疾病的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。因此，轉(zhuǎn)錄因子的深入研究對(duì)揭示機(jī)體生理功能和疾病的檢測(cè)、預(yù)防和治療有重要意義。有些核轉(zhuǎn)錄因子(如NF-κB)已成為藥物篩選的關(guān)鍵靶點(diǎn)，得到廣泛關(guān)注。近年來(lái)，相關(guān)研究取得明顯進(jìn)展。但是目前轉(zhuǎn)錄因子活性的檢測(cè)方法還相對(duì)落后，遠(yuǎn)不能滿足方便、快速和高通量檢測(cè)的需要，這在一定程度上限制了有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子以及相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)程。現(xiàn)有的檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子活性的常用方法有如下三種1.凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic mobility shiftassay，EMSA)該方法主要檢測(cè)相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合特異DNA序列的能力。主要是將細(xì)胞的核抽提物與經(jīng)放射素標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸探針(相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的核酸序列)共同孵育一段時(shí)間后，通過(guò)聚丙烯凝膠電泳和放射自顯影的方法，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)序列結(jié)合的能力。該方法具有敏感、特異的優(yōu)點(diǎn)，是目前運(yùn)用較多的方法，但卻存在著如下的不足(1)非常耗時(shí)，一般需要3天的時(shí)間；(2)有放射性污染；(3)更為突出的是不適合高通量檢測(cè)，一次僅可做12個(gè)左右的樣本；(4)結(jié)果為半定量，不準(zhǔn)確。2.基于報(bào)告基因分析的檢測(cè)如熒光素酶報(bào)告基因和β-半乳糖苷酶報(bào)告基因等。其基本原理是將熒光素酶報(bào)告基因或β-半乳糖苷酶報(bào)告基因人為構(gòu)建在含待檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子同源序列的啟動(dòng)子之后，然后再將該啟動(dòng)子構(gòu)建在表達(dá)質(zhì)粒上，利用基因轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)情況間接反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的活性。該方法具有敏感、適合高通量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，但卻存在著如下的不足(1)易受其他因素的干擾細(xì)胞上存在的其他轉(zhuǎn)錄因子往往影響待檢轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平；(2)同時(shí)該方法成功與否，還受帶報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率高低的影響；(3)結(jié)果定量誤差太大。3.免疫印跡法(Western blot)與常規(guī)Western blot方法一樣，利用相應(yīng)抗體檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白的表達(dá)情況來(lái)反應(yīng)其活性的變化。該方法具有敏感和結(jié)果客觀的優(yōu)點(diǎn)，但卻存在著如下的不足(1)耗費(fèi)時(shí)間，一般需要2～3天；(2)不適合作高通量檢測(cè)；(3)結(jié)果定量為半定量，不準(zhǔn)確。本專利技術(shù)的目的是通過(guò)這樣的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，它的步驟如下(1)合成二條與相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的單鏈DNA序列，然后，進(jìn)行退火，復(fù)性，形成DNA雙鏈，再用核酸檢測(cè)儀進(jìn)行定量，并在4℃條件下真空干燥；(2)利用核酸粘附液，將上述雙鏈DNA配成5～20pmol/μl濃度，然后加入酶鏈板的板孔中，每孔100～200μl，室溫反應(yīng)1～2小時(shí)后，將包被液倒出，用PBS緩沖液洗滌，將未結(jié)合的雙鏈DNA及粘附液充分洗滌掉，晾干備用；(3)每孔加入50～100μl、含量為2～20μg細(xì)胞或組織提取蛋白，在37℃條件下，反應(yīng)1小時(shí)，倒掉液體，用PBS緩沖液洗滌，將未結(jié)合的蛋白充分洗滌掉；(4)將針對(duì)相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的單克隆抗體用抗體稀釋液稀釋成濃度為1∶1000～2000，然后每孔加入100～200μl，在37℃條件下，反應(yīng)1小時(shí)，倒掉液體，用PBS緩沖液洗滌，將未結(jié)合的抗體洗滌掉；(5)將HRP標(biāo)記的IgG抗體用抗體稀釋液稀釋成濃度為1∶1000～2000，然后每孔加入100～200μl，在37℃條件下，反應(yīng)1小時(shí)，倒掉液體，用PBS緩沖液洗滌，將未結(jié)合的抗體洗滌掉；(6)每孔加入100～200μl顯色液，在37℃條件下，反應(yīng)2～20分鐘；(7)每孔加入100μl反應(yīng)終止液；(8)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定在波長(zhǎng)為450nm或490nm，參考波長(zhǎng)655nm時(shí)的吸光度值，一般要求5分鐘內(nèi)測(cè)完。本專利所要求的技術(shù)方案中具體如下(1)步中，是用核酸合成儀合成二條與相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的單鏈DNA序列，其單鏈DNA序列為已知序列，因檢測(cè)的核轉(zhuǎn)錄因子不同而不同；加上退火、復(fù)性等方法均是生物
成熟的方法，可以在自己實(shí)驗(yàn)室完成，也可由商業(yè)化公司完成；(2)步是本專利技術(shù)的核心內(nèi)容，主要是利用核酸粘附液將雙鏈DNA固定在酶聯(lián)板上，核酸粘附液為一種特殊的DNA塑料表面包被試劑，目前已經(jīng)商業(yè)化，由美國(guó)的PIERCE公司生產(chǎn)，使用時(shí)可以從相應(yīng)代理公司購(gòu)買，也可自己配制，具體配制方法見(jiàn)相關(guān)參考文獻(xiàn)；(3)步中，涉及細(xì)胞或組織提取蛋白，是待檢測(cè)組織或細(xì)胞的蛋白提取物，其提取方法為生物
常用的成熟方法；PBS緩沖液為常規(guī)生化試劑，可參考有關(guān)試劑說(shuō)明書進(jìn)行配制；(4)、(5)步中，涉及的抗體稀釋液為常規(guī)生化試劑，可參考有關(guān)試劑說(shuō)明書進(jìn)行配制；(6)步及(7)步中，涉及的顯色液和終止液均為常規(guī)生化試劑，可參考有關(guān)試劑說(shuō)明書進(jìn)行配制；(3)-(7)的檢測(cè)步驟均為常規(guī)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法所涉及的步驟；(8)中，檢測(cè)選用的波長(zhǎng)為450nm或490nm，參考波長(zhǎng)655nm，是按常規(guī)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法要求的，具體是因?yàn)閷＠蟮姆桨钢?5)步是用HRP標(biāo)記的IgG抗體，以后經(jīng)過(guò)顯色液顯色后，在上述波長(zhǎng)范圍內(nèi)檢測(cè)最為敏感；通過(guò)檢測(cè)吸光度值的大小，反映相應(yīng)被檢核轉(zhuǎn)錄因子活性的大小，具體原理為因?yàn)榇龣z測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子活性的大小主要通過(guò)檢測(cè)相應(yīng)核轉(zhuǎn)錄因子與對(duì)應(yīng)的特異序列的結(jié)合能力大小來(lái)反應(yīng)的，該專利要求的方案正是利用該原理，首先用核酸粘附液將相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的DNA序列包被在酶聯(lián)板孔中，然后加入含對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的蛋白樣品，通過(guò)反應(yīng)后，轉(zhuǎn)錄因子就能與包被的DNA序列結(jié)合，于后再加入對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的單克隆抗體，通過(guò)反應(yīng)后，單抗能與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合，形成單抗-轉(zhuǎn)錄因子-DNA特異序列結(jié)合的復(fù)合物，再加入能與單克隆抗體特異結(jié)合的HRP標(biāo)記的二抗，利用顯色劑顯色反應(yīng)后利用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，吸光度越大，表明轉(zhuǎn)錄因子與對(duì)應(yīng)DNA序列結(jié)合就越多，同樣其活性就越大。由于采用了上述技術(shù)方案，本專利技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)1.DNA的包被不需特殊的預(yù)活化試劑和特殊的塑料表面(一般實(shí)驗(yàn)室用的塑料表面即可)；2.包被省時(shí)一般僅需1小時(shí)，而其他包被方法至少需12小時(shí)左右；3.檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)便，無(wú)需特殊的儀器設(shè)備，省時(shí)，僅需4小時(shí)左右；4.適合作高通量檢測(cè)一次可做96個(gè)樣品，根據(jù)需要也可擴(kuò)大檢測(cè)的樣本數(shù)，如192個(gè)樣品等，特別適合作藥物的大規(guī)模的篩選；5.無(wú)放射性污染；6.靈敏度高可以對(duì)0.5μg～50μg蛋白樣品進(jìn)行檢測(cè)，其靈敏度大約為EMSA方法的10倍左右；7.定本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊清武，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：楊清武，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：