免疫反應(yīng)測(cè)定方法及其所使用的免疫反應(yīng)測(cè)定試劑技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提供了一種免疫學(xué)測(cè)定一種包含在樣本中的對(duì)象物質(zhì)的方法，其步驟包括在三羧酸或三羧酸鹽存在下和酸性條件下使對(duì)象物質(zhì)和能特異性結(jié)合到對(duì)象物質(zhì)的特異性結(jié)合物質(zhì)形成一種抗原抗體復(fù)合物。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)還提供了在此方法中使用的包含三羧酸或三羧酸鹽的試劑。試劑中包含有一種對(duì)象物質(zhì)以及能免疫學(xué)和特異性地與對(duì)象物質(zhì)結(jié)合的特異性結(jié)合物質(zhì)。制備此試劑以使得對(duì)象物質(zhì)和特異性結(jié)合物質(zhì)能在酸性條件下結(jié)合在一起以形成抗原和抗體復(fù)合物。（*該技術(shù)在2022年保護(hù)過(guò)期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)涉及能夠檢測(cè)樣本中所含的抗原或抗體(對(duì)象物質(zhì)(subject substances))的免疫反應(yīng)測(cè)定方法，以及此方法中所使用的一種免疫反應(yīng)測(cè)定試劑。
技術(shù)介紹
為明確各種疾病的診斷和判斷疾病的進(jìn)展情況，可以測(cè)定存在于人體體液內(nèi)的、具有疾病特征性的蛋白的水平。此技術(shù)已在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。使用高度特異性的抗原抗體反應(yīng)的免疫反應(yīng)測(cè)定方法主要用于此種蛋白的含量的測(cè)定。目前，多種原理已被應(yīng)用于對(duì)免疫反應(yīng)測(cè)定方法的改進(jìn)和開(kāi)發(fā)。其中，檢測(cè)抗原抗體反應(yīng)所形成的凝集復(fù)合物的測(cè)定方法，例如懸度測(cè)定法、濁度測(cè)定法、玻片凝集法及類(lèi)似方法已廣為熟知的。這些方法在溶液中進(jìn)行，其中抗原和抗體是均勻分散的，因此總稱(chēng)為均質(zhì)免疫反應(yīng)測(cè)定方法。在這些方法中，反應(yīng)體系因凝集復(fù)合物的產(chǎn)生而變得混濁，其混濁度依賴(lài)于抗原和抗體的量。懸度測(cè)定法和濁度測(cè)定法是通過(guò)光學(xué)測(cè)定混濁度的方法。在懸度測(cè)定法中，混濁度是通過(guò)測(cè)量被反應(yīng)體系散射的光量而測(cè)定的。在濁度測(cè)定法中，對(duì)混濁度的測(cè)定則是基于測(cè)量由于反應(yīng)體系的散射而發(fā)生的光透射衰減。總體而言，兩種方法使用和測(cè)定相同的反應(yīng)體系。能被一種方法測(cè)定的對(duì)象也可被另一種方法測(cè)定。玻片凝集是使用肉眼觀(guān)察或類(lèi)似方式對(duì)凝集復(fù)合物產(chǎn)生所引起的混濁度進(jìn)行測(cè)定的一種方法。玻片凝集可以使用與懸度測(cè)定法和濁度測(cè)定法相同的反應(yīng)體系。各種添加劑被嘗試用于上述傳統(tǒng)的免疫反應(yīng)測(cè)定方法中，以便能加速抗原抗體反應(yīng)并高度敏感地檢測(cè)到微量的成分。例如，在反應(yīng)體系中加入一種水溶性的聚合物，如聚乙二醇、右旋糖苷、聚乙烯吡咯烷酮、氯乙烯、或類(lèi)似物，以加速抗原抗體反應(yīng)的凝集復(fù)合物形成，通過(guò)這種方法以改進(jìn)反應(yīng)時(shí)間和測(cè)定的敏感性。這些水溶性聚合物中，已知聚乙二醇即使是在相對(duì)低的濃度下也有很好的效果。重量百分比為2-6％(以下簡(jiǎn)寫(xiě)為wt％)的、平均分子量在6,000的聚乙二醇用途廣泛。特別是當(dāng)濃度為4wt％時(shí)，其只產(chǎn)生極少量的非特異性混濁度，十分高效。水溶性聚合物的分子量或濃度增加時(shí)，其促進(jìn)抗原抗體反應(yīng)的作用也會(huì)提高(見(jiàn)于《自動(dòng)化免疫分析》第一部分，Ritchie編寫(xiě)，67-112頁(yè)(1978))。對(duì)于抗原抗體反應(yīng)的測(cè)定，依賴(lài)于抗原濃度的信號(hào)性抗原抗體反應(yīng)的強(qiáng)度越大，S/N比越令人滿(mǎn)意，即測(cè)定越穩(wěn)定。然而，若想通過(guò)使抗原抗體反應(yīng)進(jìn)一步加速以達(dá)到上述效果，那么就需要提高所加入的傳統(tǒng)的水溶性聚合物的分子量或濃度。但這樣會(huì)增加含有此水溶性聚合物的溶液的粘度，使得分析的操作過(guò)程難于把握。在均質(zhì)免疫反應(yīng)測(cè)定方法中，區(qū)帶現(xiàn)象(zone phenomenon)十分常見(jiàn)。區(qū)帶現(xiàn)象指的是，當(dāng)抗原抗體之一的量超出與其形成最大凝集復(fù)合物相當(dāng)?shù)闹亓糠秶鷷r(shí)，會(huì)妨礙凝集復(fù)合物的產(chǎn)生。著名的Heidelberger的格子假說(shuō)(lattice hypothesis)解釋了多價(jià)抗體與大于一價(jià)的抗原的結(jié)合反應(yīng)，其詳細(xì)描述見(jiàn)于William E Paul所編輯的《免疫學(xué)概要》(1984)(日文版，Kiso Menekigaku，Tomio Tada負(fù)責(zé)，714-716頁(yè)(1987))。在實(shí)際的均質(zhì)免疫反應(yīng)測(cè)定中，通常是用抗體檢測(cè)抗原的濃度，較高的測(cè)定值(即抗原的濃度)比較低的測(cè)定值通常更有意義。因此，由抗原過(guò)量所引起的區(qū)帶現(xiàn)象是常見(jiàn)的問(wèn)題。在區(qū)帶以外的區(qū)域則形成含有由抗原抗體交互連接而成的復(fù)合物的巨大分子鏈。如果抗體濃度不變，分子鏈的數(shù)量和大小隨抗原的濃度增加而增大。因此，通過(guò)檢測(cè)其光學(xué)變化可測(cè)定分子鏈的數(shù)量和大小，進(jìn)而可定量測(cè)定抗原的濃度。此外，抗原抗體復(fù)合物在溶液中形成的混濁或凝集甚至可以通過(guò)肉眼進(jìn)行觀(guān)察，這取決于抗原抗體的濃度。因此，抗原的濃度也可通過(guò)肉眼觀(guān)測(cè)而進(jìn)行定性測(cè)定。但是，在抗原過(guò)量的區(qū)域，由于抗原量遠(yuǎn)大于抗體量，結(jié)合位點(diǎn)被抗原飽和的抗體數(shù)量增加。因此，上述分子鏈的形成受到影響，反應(yīng)結(jié)果將無(wú)法分辨抗原濃度是低還是更高。因此將無(wú)法對(duì)抗原的濃度進(jìn)行正確的定量測(cè)定。為此，必須對(duì)所檢測(cè)的濃度范圍做出限定以避免上述情況。本專(zhuān)利技術(shù)的目的之一是通過(guò)提供一種能夠簡(jiǎn)便地提高測(cè)定值的免疫反應(yīng)測(cè)定方法，以及一種供此方法使用的免疫反應(yīng)測(cè)定試劑，以解決上述常見(jiàn)的問(wèn)題。本專(zhuān)利技術(shù)的另一個(gè)目的是提供一種能夠解決抗原過(guò)量的區(qū)帶現(xiàn)象的免疫反應(yīng)測(cè)定方法，以及一種供本方法使用的免疫反應(yīng)測(cè)定試劑。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為解決上述問(wèn)題，本專(zhuān)利技術(shù)用于測(cè)定樣品中的抗原或抗體(對(duì)象物質(zhì))的免疫學(xué)測(cè)定方法的特征包含步驟A將三羧酸或三羧酸鹽和能夠特異性結(jié)合對(duì)象物質(zhì)的抗體或抗原(特異性結(jié)合物質(zhì))加入至樣品中，和步驟B在步驟A生成的反應(yīng)體系中檢測(cè)由對(duì)象物質(zhì)和特異性結(jié)合物質(zhì)之間的抗原抗體反應(yīng)所生成的抗原抗體復(fù)合物，所述反應(yīng)體系包含樣品、特異性結(jié)合物質(zhì)和三羧酸或三羧酸鹽，并且抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)此反應(yīng)體系的pH值是酸性的。此外，本專(zhuān)利技術(shù)的免疫反應(yīng)測(cè)定試劑的特征包含三羧酸或三羧酸鹽和能夠特異性結(jié)合對(duì)象物質(zhì)的抗體或抗原(特異性結(jié)合物質(zhì))，且所制備的試劑能夠使得對(duì)象物質(zhì)和特異性結(jié)合物質(zhì)之間發(fā)生抗原抗體反應(yīng)時(shí)的pH值是酸性的。附圖簡(jiǎn)述附圖說(shuō)明圖1所示為使用本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例或?qū)Ρ壤拿庖叻磻?yīng)測(cè)定試劑、通過(guò)免疫反應(yīng)測(cè)定方法對(duì)人白蛋白進(jìn)行免疫懸液測(cè)定的測(cè)定結(jié)果。圖2所示為使用本專(zhuān)利技術(shù)另一個(gè)實(shí)施例的含有檸檬酸的免疫反應(yīng)測(cè)定試劑、通過(guò)免疫反應(yīng)測(cè)定方法對(duì)人白蛋白進(jìn)行免疫懸液測(cè)定的pH值相關(guān)性的檢測(cè)結(jié)果。圖3所示為使用本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例的含有反烏頭酸的免疫反應(yīng)測(cè)定試劑、通過(guò)免疫反應(yīng)測(cè)定方法對(duì)人白蛋白進(jìn)行免疫懸液測(cè)定的pH值相關(guān)性的檢測(cè)結(jié)果。圖4所示為仍然使用本專(zhuān)利技術(shù)另一個(gè)實(shí)施例的含有檸檬酸的免疫反應(yīng)測(cè)定試劑、通過(guò)免疫反應(yīng)測(cè)定方法對(duì)人白蛋白進(jìn)行免疫懸液測(cè)定的檸檬酸濃度相關(guān)性的檢測(cè)結(jié)果。圖5所示為使用本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例的含有反烏頭酸的免疫反應(yīng)測(cè)定試劑、通過(guò)免疫反應(yīng)測(cè)定方法對(duì)人白蛋白進(jìn)行免疫懸液測(cè)定的反烏頭酸濃度相關(guān)性的檢測(cè)結(jié)果。圖6所示為使用本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例或?qū)Ρ壤暮腥人峄蛉人猁}以及另一種緩沖液的免疫反應(yīng)測(cè)定試劑、通過(guò)免疫反應(yīng)測(cè)定方法對(duì)人白蛋白進(jìn)行免疫懸液測(cè)定的測(cè)定結(jié)果。圖7所示為使用本專(zhuān)利技術(shù)另一個(gè)實(shí)施例或?qū)Ρ壤暮猩窖蚩谷薈RP多克隆抗體以及檸檬酸的免疫反應(yīng)測(cè)定試劑、通過(guò)免疫反應(yīng)測(cè)定方法對(duì)人CRP進(jìn)行免疫懸液測(cè)定的測(cè)定結(jié)果。圖8所示為使用本專(zhuān)利技術(shù)另一個(gè)實(shí)施例或?qū)Ρ壤暮行∈罂谷薈RP多克隆抗體以及檸檬酸的免疫反應(yīng)測(cè)定試劑、通過(guò)免疫反應(yīng)測(cè)定方法對(duì)人CRP進(jìn)行免疫懸液測(cè)定的測(cè)定結(jié)果。圖9所示為使用本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例或?qū)Ρ壤暮行∈罂谷薈RP多克隆抗體以及反烏頭酸的免疫反應(yīng)測(cè)定試劑、通過(guò)免疫反應(yīng)測(cè)定方法對(duì)人CRP進(jìn)行免疫懸液測(cè)定的測(cè)定結(jié)果。實(shí)施本專(zhuān)利技術(shù)的最佳方式本專(zhuān)利技術(shù)涉及一種能夠簡(jiǎn)便地提高測(cè)定值的免疫反應(yīng)測(cè)定方法，以及一種供本方法使用的免疫反應(yīng)測(cè)定試劑。本專(zhuān)利技術(shù)還涉及一種能夠解決抗原過(guò)量的區(qū)帶現(xiàn)象的免疫反應(yīng)測(cè)定方法，以及一種供本方法使用的免疫反應(yīng)測(cè)定試劑。本專(zhuān)利技術(shù)人發(fā)現(xiàn)，在抗原抗體反應(yīng)體系中加入三羧酸或三羧酸鹽以維持反應(yīng)體系的pH值為酸性，可以改善由抗原抗體結(jié)合而引起的免疫反應(yīng)的測(cè)定值，并可以解決在抗原過(guò)量產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象。本專(zhuān)利技術(shù)的實(shí)施方案的免疫反應(yīng)測(cè)定方法是一種測(cè)定樣品中的抗原或抗體(對(duì)象物質(zhì))的方法，其特征包含步驟A將三羧酸或三羧酸鹽和能夠特異性結(jié)合對(duì)象物質(zhì)的抗體或抗原(特異性結(jié)合物質(zhì))加入本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于測(cè)定以包含在樣品中的抗原或抗體為對(duì)象物質(zhì)的免疫反應(yīng)測(cè)定方法，包括：步驟Ａ：在樣品中加入三羧酸或三羧酸鹽和一種作為特異性結(jié)合物質(zhì)的能夠特異性地結(jié)合對(duì)象物質(zhì)的抗體或抗原；以及步驟Ｂ：在由步驟Ａ構(gòu)成的一種反應(yīng)體系中檢測(cè)由對(duì)象物質(zhì)和特異性結(jié)合物質(zhì)之間的抗原抗體反應(yīng)所生成的抗原抗體復(fù)合物，所述反應(yīng)體系包含樣品、特異性結(jié)合物質(zhì)和三羧酸或三羧酸鹽，其中的反應(yīng)體系的ｐＨ值當(dāng)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行時(shí)是酸性的。

【技術(shù)特征摘要】
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【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：龜井明仁，權(quán)丈紀(jì)子，河村達(dá)朗，平井真人，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：JP[日本]