一種檢測輻射腎性骨礦物鹽損傷方法技術

本發明專利技術屬輻射生物學與骨生物學領域，具體涉及一種輻射腎性骨礦物鹽損傷檢測方法。本發明專利技術利用＃＋［１３７］Ｃｓγ射線照射腎區致腎臟損傷，通過檢測骨礦鹽量與骨結構的改變，建立輻射腎性骨病檢測方法，研究腎區放射治療誘發骨礦鹽損傷的病理機制和防治方法，研究中醫“腎主骨”理論的本質和補腎治療骨礦鹽疾病的方法和機理，為骨礦鹽代謝的基礎研究和有關防治藥物研究提供了新的技術手段。（*該技術在2022年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬輻射生物學與骨生物學領域，具體涉及本專利技術利用137Csγ射線照射腎區致腎臟損傷，通過檢測骨礦鹽量與質的改變，建立輻射腎性骨病檢測方法。本專利技術通過下述步驟建立輻射腎性骨礦物鹽損傷檢測方法。1.腎臟照射，取實驗動物SD大鼠麻醉狀態下側向暴露其兩側腎臟，并將動物側臥位固定于模具上，用厚度4.2cm，射線衰減98％的鉛板遮擋腎臟以外的組織，達到精確定位并避免腎臟以外組織受到照射。照射計量為10-50Gy。2.腎損傷檢測血尿素氮、肌酐動態監測每2個星期尾靜脈取血，自動生化分析儀測定濃度。尿量、尿蛋白、尿肌酐清除率、尿β2微球蛋白動態監測每2個星期收集24小時尿液，測定尿量，自動生化分析儀測定尿蛋白和尿肌酐濃度(根據24h尿量，血肌酐，尿肌酐的值計算肌酐清除率)，放射免疫法測定β2微球蛋白的濃度。維生素D羥化檢測血清中1，25(OH)2D3水平可間接反反映腎臟1α羥化酶活性。每月尾靜脈采集血清0.6ml，放射免疫法測定25(OH)D3和1，25(OH)2D3，以反映腎1α羥化酶活性。腎臟病理觀察光學顯微鏡觀察照射6周后處死動物，取左側腎臟入Susa固定液固定12小時后用95％酒精洗滌，常規石蠟包埋，切片，HE染色后光學顯微鏡觀察。電子顯微鏡觀察動物處死后立即取3塊1mm3大小的右側腎皮質入2.5％戊二醛固定后作電鏡切片觀察。腎臟羥化酶表達水平檢測(1)制作腎臟冰凍切片，免疫組織化學法觀察腎近曲小管1α羥化酶表達水平。(2)腎勻漿檢測法腎臟勻漿，加入定量25(OH)D3，檢測1，25(OH)2D3產物水平。3.骨礦鹽損傷檢測骨密度測定取第四腰椎，右側股骨，剔除軟組織，蒸餾水沖洗骨髓腔，120℃干燥1小時，固體密度儀測定骨密度；骨形態計量學測定處死前14d，4d分別腹腔注射鹽酸四環素30mg/kg體重。取左側股骨上段，剔除軟組織，PBS沖洗骨髓腔。Million`s液固定72h(4℃)，每24h換液一次。乙醇梯度脫水，甲基丙烯酸甲酯滲透包埋。硬化后不脫鈣切片機切5μm，15μm兩種切片。厚片用中性樹脂封片后在熒光顯微鏡下觀察，薄片用乙二醇乙醚乙酸酯脫塑，2％甲苯胺蘭染色后作形態計量學分析，測定骨小梁體積、平均骨小梁厚度、平均骨小梁間距、結點末端比、骨形成表面、骨吸收表面、礦化沉積率。本專利技術以腎區輻照模具固定暴露腎臟，應用137Csγ射線一次照射雙側腎臟各10-50Gy，引起腎臟放射損傷，表現在尿蛋白明顯增加，尿β2微球蛋白增高，血清肌酐清除率降低1/3-1/2。由于腎1α羥化酶活性受抑，血清1，25(OH)2D3水平明顯低下，下降近1/2。2月后發生骨礦鹽結構的明顯改變，表現為骨密度下降、骨小梁體積減少、骨小梁平均間距增寬、結點末端比下降等。本專利技術通過手術暴露雙側腎臟，并用鉛板遮擋腎臟以外的組織，使腎臟照射定位準確，且最大限度地降低了腎臟周圍組織的受照劑量。通過射線照射腎臟引起骨礦鹽損傷方法的建立，為骨礦鹽代謝的基礎研究和有關防治藥物研究提供了新的技術手段。操作過程麻醉及腎臟暴露各組動物稱重，腹腔注射11％烏來糖0.5ml/100g體重+鹽酸氯胺酮0.2ml/100g體重。剔毛，常規消毒鋪巾。大鼠右側臥位，在腰大肌外側0.5cm處自肋下緣向下作一長1cm的縱行切口。小心打開腹腔。用手在體表觸及左側腎臟，輕輕將其經切口推至體外。生理鹽水紗布覆蓋保護。然后動物左側臥位，暴露右側腎臟。動物固定動物右側臥于模具中，將頭尾及四肢固定。使動物腎臟與鉛板的孔吻合對準。照射將固定好的B組動物(A組除本步與B組不同外，其余相同)放入輻照系統的輻照腔，打開輻射源，分別給予雙腎各15Gyγ射線照射。照射后處理將腎臟放回腹腔，分層縫合，關腹前腹腔注射青霉素抗感染。未蘇醒的大鼠置于溫暖處。蘇醒后給予正常飲水、飲食、光照。腎功能及骨代謝檢測方法同上述技術方案。實驗結果表明A、B兩組動物的尿量在照射后各時間段基本無顯著變化。但隨著時間的延長，A組動物的血肌酐清除率基本無變化，而B組動物的血肌酐清除率逐漸下降，說明腎臟的照射導致腎小球濾過功能的降低。與A組相比較，B組動物的尿β2微球蛋白/尿肌酐值明顯升高，說明射線致腎小管功能一定程度的損傷。掃描電鏡可見腎小球基底膜呈不規則改變，毛細血管腔明顯擴大，細胞外間隙內可見游走炎癥細胞并有大量原膠原沉積，腎小管細胞數減少，細胞線粒體明顯腫脹，光密度明顯降低。證實本專利技術方法采用15Gyγ射線局部照射大鼠雙側腎臟可導致腎小球、腎小管功能的進行性下降，以至慢性腎功能衰竭的發生。上述照射所至腎臟的損傷可以通過幾個方面影響骨礦鹽代謝，如Ca，P經尿液的過量丟失使血Ca，血P失平衡，近曲腎小管上皮細胞的破壞使合成活性維生素D所必需的1α羥化酶減少，繼發性甲狀旁腺激素(PTH)分泌增加可導致骨吸收的增強。骨密度及骨形態計量學結果證實了骨礦鹽代謝的改變。與A組比較，B組動物的腰椎、股骨密度均有所下降，其中又以腰椎更為明顯。照射動物的骨小梁體積減小，骨小梁平均間距增寬，結點末端比減小，骨形成表面減小，平均骨小梁間距、骨吸收表面增大，礦化沉積率下降。腎臟電鏡觀察見，B組腎小球基膜間隙纖維增生，近曲小管線粒體腫脹，電子密度降低，甚至有空泡樣改變；A組無有纖維增生現象，近曲小管線粒體致密清晰，電子密度較高，無腫脹等改變。表1是實驗動物尿蛋白變化結果。表2是血清肌酐清除率(％)。表3是實驗結束時測得腎功能指標。表4是實驗結束時血尿常規生化指標。表5是實驗結束時血25(OH)D3、1，25(OH)2D3、PTH及尿PYD/肌酐結果。表6是腰椎骨密度及成分分析結果。表7是股骨骨密度及成分分析結果。表8是骨形態計量結果。表9是骨礦化沉積率結果。表10是羥化酶活性。表1組別 照射后2周 4周 6周正常組(A)0.895±0.123 1.017±0.189 0.823±0.038照射組(B)1.727±0.378**1.728±0.169**1.983±0.583*注照射后2、4、6周，與正常組比較，照射組*p＜0.05，**p＜0.01表2組別 第一周第二周A66.440±10.76 56.69±4.96B32.23±11.75**20.46±5.34**注與正常組比較，照射組*p＜0.2(無統計學差別)，**p＜0.01表3組別 血尿素氮 血肌酐 尿β-2微球蛋白(mmol/L) (mmol/L)(g/mL)A6.19±0.6548.19±2.12 0.28±0.07B10.91±1.15*70.31±7.18 0.36±0.08*單因素方差分析，*P＜0.05。(mean±s，n＝10)表4組別 血Ca 血P 血ALP尿Ca 尿P(mmol/L) (mmol/L) (U/L)(mmol/L) (mmol/L)A 2.87±0.021.87±0.15123.40±18.643.79±2.46 5.46±3.98B 2.79±0.071.71±0.13140.70±31.60*6.03±2.07*6.49±3.61*單因素方差分析，*P＜0.05。(mean±s，n＝10)表525(OH)D31，25(OH)2D3PTH PYD/肌酐組別(ng/mL)(pg/mL) (n本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種輻射腎性骨礦鹽損傷檢測方法，其特征在于利用射線照射致腎臟損傷后，檢測骨礦鹽量與質的改變，建立輻射腎性骨病檢測方法。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：王洪復，高林峰，朱飛鵬，錢志林，金慰芳，
申請(專利權)人：復旦大學，
類型：發明
國別省市：31[中國|上海]