檢測瘦素的方法技術

本發明專利技術提供一種測定樣品中瘦素的方法，所依據的是對某些細胞或細胞線，例如Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３ Ｆ４４２Ａ鼠前脂肪細胞或人骨髓基質細胞線ｈＭＳ２－１２內瘦素誘導的血管生成素－２表達的檢測。瘦素的檢測為：用含有血管生成素－２啟動子調控下的報道基因（例如綠色熒光蛋白（ＧＦＰ））的載體轉染細胞。（*該技術在2020年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術是關于瘦素活性系統，更具體地，本專利技術是關于體外檢測瘦素或擬瘦素生物活性的物質，本檢測法適用于分子文庫的高效篩選。瘦素(leptin)是肥胖基因的產物(Zhang，Y.，et al.1994，Nature 372，425)，作為一種外周信息可傳遞至調節攝食與能量代謝的腦區，瘦素被認為通過其受體OB-R在下丘腦部位發揮作用(Tartaglia，L.A.，et al，1995，Cell 83，1263)。嚙齒動物的基因突變阻礙了瘦素或全長瘦素受體OB-R的正常表達，造成深度肥胖、糖尿病、代謝率降低(ColemanD.L.1978，Diabetologial4，141，)。然而，在人類，并未顯示肥胖與編碼瘦素或OB-R基因的突變相關(Considine，R.V.，et al.1995，J.Clin.Invest.95，2986；Considine，R.V.，et al，1996，Diabetes19，992)。雖然發生肥胖基因突變的小鼠在給予重組的瘦素后，可恢復正常體重(Pelleymounter，M.a.，etal.1995，Science 269，540 Halaas，J.L.，et al，1995，Science 269，543；Campfield，L.A.，etal，Science 269，546)，但這一方法看來不能在肥胖的人中獲得成功，因為肥胖人血清中的瘦素水平長期較高(Maffei，M.，et al，1995，Nature Med.1，1155；Considine，R.V.，et al.，1996，N.Engl.J.Med.334，292；Sinha，M.K.，et al.，1996，J.Clin.Invest.98，1277)，因此肥胖的人表現為“瘦素抗性”(Maffei，M.，et al，1995，NatureMed.1，1155；Flier，J.S.&Elmquist，J.k.1997，Nature Biotech.15，20；Campfield，L.A.，etal，1996，Horm.Metab.Res.28，619)，在肥胖人中并不產生與血清瘦素水平相對應的信號。也許是由于瘦素通過血腦屏障的傳輸缺陷(Caro，J.F.，et al 1996，Lancet348，159)或缺乏適當的OB-R應答。對OB-R信號通路分析顯示。肥胖人接受選擇性治療，可提高OB-R的應答，可克服瘦素抗性并使肥胖逆轉。瘦素與OB-R分別是四螺旋束細胞因子和受體大家族的成員(Tartaglia，L.A.，et al，1995，Cell83，1263；Madej，T.，et al，1995，FEBS Lett.373，13)。OB-R與信號傳遞受體的糖蛋白gp130密切相關，gp130被白介素-6與親膽堿能神經元因子(CNTF)所激活，該信號傳遞通路已被重點研究(Kishimoto，T.，et al，1992，Science 256，593；Stahl，N.&Yancopoulos，G.D.1994，J.Neurobiology 25，1454)。瘦素受體被翻譯為具有不同細胞區域的幾種剪接產物(Tartaglia，L.A.，etal，1995，Cell 83，1263；Lee，G-H.，et al 1996，Nature379，632；Chen，H.，et al，1996，Cell 84，491；Cioffi，J.A.，et al，1996，Nature Med.2，585；Wang M.Y.，et al，1996，FEBSLett.392，87)，但是，僅有一種稱為長形或OB-Rb的異構形式顯示能介導瘦素的體重控制效應(Lee，G-H.，et al 1996，Nature379，632；Chen，H.，et al，1996，Cell84，491；Ghilardi，N.，et al，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93，6231；Baumann，H.，et al，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，8374)。糖尿病肥胖(db)小鼠的OB-R發生突變，阻礙了OB-R長片段異構形式的表達，而使它們不能適當地介導瘦素的作用(Lee，G-H.，et al 1996，Cell 84，491)。發現新的具生物活性的分子用作治療威脅生命疾病的藥物，這種發現包括兩個基本操作(1)多少帶有隨機性的分子選擇，或經化學合成或從自然源中分離制備；(2)檢測候選分子的性質。專利技術過程的重復性是無法預料的，一直到具理想性質的分子被確定。在大多數情況下，用于檢測所選擇的分子類型屬于相當狹窄的化學類型。例如新的肽激素的發現包括了對肽的研究，新的治療用類固醇的發現包括類固醇核的研究，新的功能性分子的發現，特別在自然界，主要靠“運氣”，極大地耗費時間、辛勤的工作、昂貴的經費，并且是不可預知的。生物學活性的現代理論闡述，生物學活性及生理學狀態是分子識別的結果。例如核苷酸能夠形成互補的堿基對，這樣互補的單鏈分子雜交，導致形成雙鏈或三鏈的螺旋結構，它們似乎與基因表達的調節有關。另一個例子是稱為配體的生物活性分子與另一分子(通常是稱為配體的受體的大分子(例如受體或酶))相結合，這種結合形成的分子反應鏈最后導致產生一種生理狀態，例如導致正常細胞生長、分化；導致癌瘤形成的異常細胞生長；血壓調節；產生神經脈沖與傳播。配體與配體受體的結合具幾何學的特點，有非常高的特異性，涉及合適的三維結構排列和化學相互作用。目前，開發用于治療疾病的藥物的有效策略包括發現生物受體、酶或與相應的大分子相結合的配體形式，它們模擬配體增強(激動)、或抑制(拮抗)受體產生的活性。尋找理想配體的工作傳統地一直在進行，或是通過隨機地篩選相關分子(通過化學合成或從自然來源中進行分離，例如見K.Nakanishi，ActaPharm.，1992，4，319-328.)，或通過所謂“合理的”途徑進行，包括對主導結構(通常是天然配體)的鑒別，經歷多次結構再設計和生物學測試，使其性質最優化，(例如，見Testa，B.&Kier，L.B.Med.Res.1991，11，3548Rotstein，S.H.&Mureko，M.A.，J.Med.Chem.1993，36，1700)。由于專利技術最有用的藥物不是通過“合理的”途徑，而是通過對化合物隨機的篩選，近來出現一種尋找藥物的混合途徑，即以組合化學法構建隨機形成的化學結構物的巨大文庫，再從中篩選特異生物活性(Brenner，S&Lerner，R.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，89，5381)，從如此巨大的隨機形成的化學結構文庫中進行篩選，需要有成本合算的生物學測試方法，并使這種測試法自動化。傳統的體內是給Ob/Ob小鼠進行注射，觀察小鼠體重減輕情況。該生物學測定方法麻煩、費時，且無重復性，也不適于對含有數百萬化合物的文庫進行高流通量(high throughput)的篩選。但還是有一些較簡單的檢測系統。例如含YXXQ序列的長OB-R的發現(Tartaglia，L.A.，et al本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測瘦素或瘦素樣物質存在的方法，其特征在于包括將樣品與對瘦素產生應答而表達Ａｎｇ－２的細胞或細胞線接觸，并測定培養基中的Ａｎｇ－２、編碼Ａｎｇ－２的細胞ＲＮＡ或Ａｎｇ－２啟動子的活化。

【技術特征摘要】
...

【專利技術屬性】
技術研發人員：M魯賓斯坦，B科恩，
申請(專利權)人：耶達研究發展有限公司，
類型：發明
國別省市：IL[以色列]