用于肝細胞癌診斷的方法和組合物技術

本發明專利技術提供了用于肝細胞癌篩選、診斷、預后、和用于監測肝細胞癌治療效果和藥物開發的方法和組合物。描述了可以使用雙向電泳分析血清或血漿來測定的肝細胞癌診斷特征（ＨＦ）。本發明專利技術進一步提供了在血清或血漿中可檢出的肝細胞癌診斷蛋白質同種型（ＨＰＩ）、包含已分離的ＨＰＩ的制劑、針對ＨＰＩ的免疫特異性抗體，以及包含前述的試劑盒。（*該技術在2019年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
1．簡介本專利技術涉及與肝細胞癌(hepatoma)相關的蛋白質和蛋白質同種型(isoform)的鑒定，以及它們在篩選、診斷、預后、治療和藥物開發方面的用途。2．專利技術背景肝細胞癌是一種發病率不斷上升的癌癥，世界范圍內有幾十萬患者。此病的治療方法還相對缺乏，獲得更有效治療的主要希望在于能夠更早和更準確的診斷。血清甲胎蛋白(AFP)的測定廣泛應用于肝細胞癌的診斷。當AFP水平顯著上升時，它是一個有用的標志物，但是當AFP在較低水平時，它對于肝細胞癌很差的特異性和陽性檢出率(PPV)嚴重的限制了其臨床應用。Johnson等人，1997，英國癌癥雜志(Br.J.Cancer)，75236-240。某些凝集素與肝細胞癌血清中的AFP的結合顯示出不同于與良性狀況下的AFP的結合。Aoyagi等人，1985，生物化學生物物理通報(Biochim.Biophys.Acta)，830217-223；Aoyagi等人，1993，英國癌癥雜志，67486-492。但是這些研究還未被臨床廣泛的接受。Johnson等人，同上。最近，等電聚焦已經用于AFP同種型的檢查，這些同種型表現出對肝細胞癌相對特異性。Johnson等人，同上。這些報道說明在肝細胞癌的診斷中越來越需要鑒定血清中的標志物。3．專利技術概述本專利技術提供了用于肝細胞癌的篩選、診斷和預后、用于監測肝細胞癌治療有效性和用于藥物開發的方法和組合物。專利技術的第一方面提供了用于肝細胞癌診斷的方法，包括通過雙向電(two-dimentional electrophoresis)對血漿或血清樣品進行分析，以檢測至少一種肝細胞癌診斷特征(HF)的水平，例如選自此處所公開的HF中的一種。這些方法也適用于篩選、預后、監測治療效果和藥物開發。專利技術的第二方面提供了用于肝細胞癌診斷的方法，包括檢測血漿或血清樣品中至少一種肝細胞癌診斷蛋白質同種型(HPI)的水平，例如選自此處所公開的HPI組中的一種。這些方法也適用于篩選、預后、監測治療效果和藥物開發。專利技術的第三方面是提供了能夠與一種HPI，例如此處公開的一種HPI，免疫特異性結合的單克隆和多克隆抗體專利技術的第四方面是提供了一種制品，該制品包含一種已分離的HPI，即一種不含與HPI有明顯不同表觀分子量或等電點的蛋白質或蛋白質同種型的HPI。4．附圖簡述附圖說明圖1是由正常人血清的雙向電泳得到的圖像，圖像顯示鑒定出了14個界點特征，標記為PL1-PL12和PL15-PL16。5．專利技術詳述以下詳細敘述的專利技術包括用于哺乳動物受試者中肝細胞癌篩選、診斷、預后的方法和組合物，以及用于肝細胞癌治療效果監測的方法和用于藥物開發的方法。優選地，受試者是人，更優選地，受試者是成年人。為了公開清楚而不以任何方式限制，本專利技術將以血清樣品的分析為例進行描述。但是，作為一個本領域的技術人員應當理解，此處所述的鑒定和技術可以應用于其它類型的病人樣品，包括體液(例如血漿、尿液、膽汁、腹水)、懷疑含有來源于肝細胞癌物質的組織樣品(例如肝臟活檢或可疑腫塊活檢的活檢樣品)或其勻漿。5．1．肝細胞癌診斷特征(HF)在本專利技術的一個方面中，雙向電泳用于分析受試者血清以測量一個或多個肝細胞癌診斷特征(HF)的豐度，可用于肝細胞癌的篩選和診斷、決定肝細胞癌患者的預后、監測肝細胞癌治療的效果或者用于藥物的開發。此處所用的雙向電泳是指一項包括等電聚焦和隨后的變性電泳在內的技術。它可以產生包含多個已分離的蛋白質的雙向膠(2D-gel)。優選地，，變性電泳步驟使用十二烷基磺酸鈉存在下的聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)。特別優選的是美國申請第08/980，574和WO 98/23950中所描述的高度準確和自動化的方法及設備(“優選技術”)，此處完整引述作為參考。簡要的說，優選的技術提供了足夠的、計算機輔助的方法和設備以用于生物樣品中生物分子的鑒定、選擇和特征描述。根據生物分子的電泳遷移率和等電點在雙向膠中分離它們，可以得到一個雙向圖譜(array)。由此圖譜可以產生一個計算機形成的數字圖形，代表雙向圖譜中檢測的多種生物分子的特性、表觀分子量、等電點和相對豐度，因而能夠允許將來自多個生物樣品的圖形進行計算機輔助的比較，以及計算機輔助的已分離目標蛋白質的切割。此處所用的術語“肝細胞瘤診斷特征(HF)”指的是在生物樣品經雙向電泳后可檢出的特征(例如雙向膠中的一個點)，它以不同的方式表現在一個樣品和另外的與其相關樣品中，例如在一個患有肝細胞癌的受試者血清中與在一個沒有患有肝細胞癌的受試者血清中。當用于檢測特征(或蛋白質同種型)的方法(例如雙向電泳或免疫分析方法)顯示所檢測特征(或蛋白質同種型)在第一個樣品中與在第二個樣品中的相對豐度不同時，則此處所用的術語特征(或蛋白質同種型)相對于第二個樣品而言，“不同的存在于”第一個樣品中。如果所測量的特征在第一個樣品中的豐度高于在第二個樣品中的量，則相對于第二個樣品，特征或同種型在第一個樣品中是“升高”的；相反的，如果所測量的特征在第一個樣品中的豐度低于在第二個樣品中的量，則相對于第二個樣品，特征或同種型在第一個樣品中是“降低”的。優選的，特征在兩個樣品中的相對豐度是通過兩個步驟來確定的。首先，參照一個適當的背景參數將依賴于樣品中所發現特征而得到的信號進行標準化，例如，參照分析樣品中的總蛋白質(例如上樣到膠上的總蛋白質)，參照一個穩定的特征，也就是已知的在所比較的樣品中含量相似的一個特征，例如一個或多個“表達參考特征”(ERF)，例如下面公開的“表達參考特征”，或者參照來源于樣品中所有蛋白質的能檢測到的總信號。其次，一個或一組樣品中已標準化的特征的信號與另外一個或一組樣品中同一特征的已標準化的信號相比較，用以鑒定那些相對于第二個樣品(或樣品組)“不同的存在于”第一個樣品(或樣品組)中的特征。通過優選技術部分中的方法和設備，已鑒定出兩組HF。第一組包括相對于無肝細胞癌受試者血清(例如患有肝硬化的受試者)在患有肝細胞癌的受試者血清中降低的HF。這些HF可以用表觀分子量(MW)和等電點(PI)表述如下表Ⅰ在肝細胞癌血清中降低的HF 第二組包括相對于無肝細胞癌受試者血清(例如，患有肝硬化的受試者)在患有肝細胞癌的受試者血清中升高的HF。這些HF可以用表觀分子量(MW)和等電點(PI)表述如下表Ⅱ在肝細胞癌血清中升高的HF 表Ⅱ(續) 對于任何指定的HF來說，將分析患有肝細胞癌的受試者血清時觀察到的標準化信號與相對于分析無肝細胞癌的受試者血清時觀察到的標準化信號加以比較，所得到的比率依賴于所用的特定分析規程和檢測技術。因而，本專利技術構思了作為診斷領域的傳統做法，每一個實驗室應當根據所使用的分析規程和檢測技術建立針對無肝細胞癌受試者血清中每一個HF的參考范圍。優選的，分析測試樣品時每一批次中應當包括至少一個來自已知患有肝細胞癌的受試者的陽性對照血清樣品，和至少一個來自已知無肝細胞癌的受試者的陰性對照血清樣品(更優選的是至少一個陽性和至少一個陰性對照樣品)。作為熟練的技術人員應當容易理解，一個給定特征或蛋白質同種型的測量分子量和等電點會根據雙向電泳和區帶匹配的每一步驟所用的具體規程而在一定范圍內變動。此處所用的術語“分子量”和“等電點”分別定義為準確依照在下文第六節列出的實驗規本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于人類受試者中肝細胞癌的篩選、診斷或預后，或者用于監測向人類受試者施用的抗肝細胞癌藥物或治療的效果的方法，包括：（ａ）用雙向電泳分析受試者血清或血漿樣品，以產生特征的雙向圖譜；（ｂ）對于強度與肝細胞癌的存在與否相關的至少兩個所 選特征，將所選特征中的每一個特征在樣品中的強度與在一個或多個無肝細胞癌的受試者血清或血漿中所選特征的強度相比較，其中，樣品中所選特征的強度表明受試者存在或不存在肝細胞癌。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：RB帕爾克，TP帕特爾，RR唐森德，C莫伊賽斯，PJ約翰遜，
申請(專利權)人：牛津糖科學英國有限公司，
類型：發明
國別省市：GB[英國]