體外檢測肝細(xì)胞癌存在的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種對肝細(xì)胞癌有特異性的致癌蛋白質(zhì)和一種編碼了這種蛋白質(zhì)的核苷酸序列。本發(fā)明專利技術(shù)還涉及使用該癌蛋白（或它的特異抗體）和核苷酸序列的篩選和診斷方法和根據(jù)該方法而建立的藥盒。（*該技術(shù)在2010年保護(hù)過期，可自由使用*）

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本申請是申請?zhí)枮?0110448.5，申請日為1990年12月19日，專利技術(shù)名稱為“肝細(xì)胞癌致癌基因”的專利技術(shù)專利申請的分案申請。本專利技術(shù)總的來說，涉及一種肝癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)，具體地說本專利技術(shù)涉及一種致癌蛋白質(zhì)，它是肝癌細(xì)胞的一種放大的基因表達(dá)產(chǎn)物。本專利技術(shù)還涉及到編碼這種致癌蛋白質(zhì)的核苷酸片段、包含這種片段的重組分子和用它轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。本專利技術(shù)還涉及到檢查病人體內(nèi)肝癌存在的方法以及在此基礎(chǔ)上的藥盒。流行病學(xué)表明人類的某些癌癥和其他疾病的發(fā)生與幾種DNA病毒有很密切的病因?qū)W相關(guān)性。這些病毒包括頸部癌癥(HPV16.)和疣狀表皮發(fā)育障礙中(HPV3和8)的乳頭狀瘤病毒；非洲淋巴瘤中的EB病毒；和人肝細(xì)胞癌中的乙型肝炎病毒(HBV)(Beasley et.al,In:Vyas GN,Dienstag J.L,Hoofnagle JH,eds。“病毒性肝炎和肝臟疾病”O(jiān)rlando,FL,Grune and Stratton,1984,209-224)。這些發(fā)現(xiàn)，以及逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染如HTLV-1在成熟的T細(xì)胞中白血病的相關(guān)性表明傳染性病毒在上述人類腫瘤和疾病的發(fā)病機理中可能起著轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的作用。根據(jù)該機制，相信傳染性病毒是通過與宿主細(xì)胞DNA進(jìn)行DNA重組而產(chǎn)生影響的。哺乳動物基因組中含有某些基因(被稱為致癌基因前體)，在被轉(zhuǎn)移到急性轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中時，它能獲得致癌性質(zhì)(Bishop,Ann.Rev.Biochem.1983,52:301；Bishop,Cell 1985,42:23)。在特定的人類癌癥中(如，T24和EJ人膀胱癌)，已經(jīng)證實鑒定出的轉(zhuǎn)化基因(H-ras-1位點)與Harvey鼠肉瘤病毒的V-rasH有關(guān)。在致癌基因前體和致癌基因中，該ras族已經(jīng)被完全表征，并且對在人類肝瘤中的活化和表達(dá)進(jìn)行了研究。當(dāng)一種致癌基因前體經(jīng)過點突變(如C-rasH)或者重排(如n-myc)，這種改變可以引起分化和生長過程中細(xì)胞調(diào)節(jié)的喪失，并且最終產(chǎn)生致癌性。最近，從人(Mahlavu)肝細(xì)胞癌中得到的一種轉(zhuǎn)化DNA順序，hhcM已被鑒別并且被分子克隆成為一種大片段的部分片段(Yang et al,J.Gen.Virol.1982,63:25；Yang et al,Environmental HealthPerspectives 1985,62:231)。從另外幾種人肝細(xì)胞癌中分離出一些對NIH/3T3細(xì)胞適度轉(zhuǎn)化活性顯示為零的，hhcM相關(guān)DNA克隆。已經(jīng)有兩種被部分地表征，它們是從Mahlavu肝細(xì)胞癌中得到的適當(dāng)?shù)丶?xì)胞-轉(zhuǎn)化基因(hhcM)和一種從正常人體肝臟DNA中分離的，推斷的細(xì)胞同系物(C-hhc)它不具有細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性。已經(jīng)表明了二種hhcM和一種Korean hhcK3的分子克隆與C-hhc的生物活性特征并加以比較(Yang et al，白血病1988,2(12增刊)102S)。觀察了hhcM序列在來源于2個中國人，1個非洲人和17個朝鮮人肝細(xì)胞瘤的幾種基因組DNAS中的放大反應(yīng)，并且與在相同肝細(xì)胞瘤中整合的HBV DNA序列的分布進(jìn)行了比較，以便對hhcM的可能的作用提供一些了解。本專利技術(shù)涉及到一種肝細(xì)胞癌特異的癌蛋白和一種編碼這種蛋白質(zhì)的核苷酸順序。本專利技術(shù)還涉及到利用該癌蛋白(或它的特異抗體)和核苷酸順序進(jìn)行診斷和篩選的方法(在此基礎(chǔ)上建立的藥盒)。本專利技術(shù)的一個目的是提供一種肝細(xì)胞癌蛋白和一種編碼它的核苷酸序列。本專利技術(shù)的另一個目的是提供一種肝細(xì)胞癌的存在和肝臟癌前或病理狀態(tài)的診斷檢查。該技術(shù)中的熟練人員通過下面的描述可以清楚地知道本專利技術(shù)的其它目的和優(yōu)點。在一個優(yōu)選方案中，本專利技術(shù)涉及到一種編碼了附圖說明圖1中的氨基酸序列或該序列的一種等位基因變異體或該序列的一個特定部分的DNA片段。在另一個優(yōu)選方案中，本專利技術(shù)涉及一種重組體DNA分子，它們合有ⅰ)一種載體，和ⅱ)上述DNA片段在另一個優(yōu)選方案中，本專利技術(shù)涉及到用上述重組DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在另一個優(yōu)選方案中，本專利技術(shù)涉及到與上述DNA片段充分互補并與之雜化的一種核苷酸片段。在還有一個優(yōu)選方案中，本專利技術(shù)涉及到一種具有圖1中氨基酸序列或該序列的一種等位基因變異體或該序列的一個特定部分的蛋白質(zhì)。在另一個優(yōu)選方案中，本專利技術(shù)涉及到上述蛋白質(zhì)的特異抗體(多克隆的和/或單克隆的)。在另一個優(yōu)選方案中，本專利技術(shù)涉及到一種產(chǎn)生上述蛋白質(zhì)的方法，包括在可以表達(dá)DNA片段的條件下培養(yǎng)一種用上述重組DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生該蛋白質(zhì)；并分離該蛋白質(zhì)。在另一個實施例中，本專利技術(shù)涉及到一種檢查樣本中上述蛋白質(zhì)存在的檢查方法，包括ⅰ)在可以使抗體與蛋白質(zhì)結(jié)合的條件下將樣本與該蛋白質(zhì)特異性抗體接觸，從而形成一種復(fù)合物；和ⅱ)檢測該復(fù)合物的存在。在另一個實施例中，本專利技術(shù)涉及到一種檢查樣本中存在編碼上述蛋白質(zhì)的核苷酸序列的方法，包括ⅰ)在可以進(jìn)行雜化反應(yīng)的條件下將樣本與該核苷酸序列充分互補的核苷酸片段接觸，使它們發(fā)生雜化，從而形成一種復(fù)合物；和ⅱ)檢測該復(fù)合物的存在。在另一個實施例中，本專利技術(shù)涉及到一種病人肝細(xì)胞癌存在的診斷方法，包括ⅰ)將從病人的生物學(xué)樣本與上述抗體在使得抗體與樣本中蛋白結(jié)合的條件下進(jìn)行接觸，從而形成一種復(fù)合物；和ⅱ)檢測這種復(fù)合物的存在。在另一個實施例中，本專利技術(shù)涉及到一種診斷病人肝細(xì)胞癌存在的方法，包括ⅰ)將從病人的細(xì)胞樣本中獲得的核酸序列與上述核苷酸片段在可以進(jìn)行雜化反應(yīng)的條件下接觸，從而形成一種復(fù)合物；和ⅱ)檢測這種復(fù)合物的存在。在另一個實施例中，本專利技術(shù)涉及到用于檢查樣本中存在上述蛋白質(zhì)的一種診斷藥盒，它包括一種盛有該蛋白質(zhì)特異性抗體的容器。在另一個實施方案中，本專利技術(shù)涉及到一種用于檢查一種核酸序列的存在的診斷藥盒，這種核酸序列編碼了一種具有圖1所描述的氨基酸序列或該序列的一種等位基因變異體，或它的一個特定部分的蛋白質(zhì)，這種藥盒包含有一個盛有上述核苷酸片段的容器。圖1表示hhcM的完整核苷酸序列，和一種編碼了其開放閱讀框架中的52,000道爾頓蛋白質(zhì)的氨基酸序列。圖2表示產(chǎn)生hhcM52KD蛋白質(zhì)的hhcM-Lacz嵌合質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。圖3表示結(jié)合到從人肝細(xì)胞癌(Mahlavu)，人正常肝和從鼠(NIH/3T3)成纖維細(xì)胞中制備的大分子量DNAs上的黃曲霉素B1環(huán)氧化物。圖4表示用一種改良的Maxam-Gilbert定序法來識別在hhcM(PM-1)DNA中的AFB1環(huán)氧化物結(jié)合的dG。在一旁列出了核苷酸序列。左側(cè)的譜帶表示對應(yīng)于全部四種6脫氧核苷酸和AFB1-dG的梯形譜帶；右側(cè)的另外三個譜帶中只給出了天然dG和AFB1-dG。在全部時間過程中aG=AFB1結(jié)合的dG；°G=不與AFB1反應(yīng)的dG；而°G=適度優(yōu)選的dG。圖5表示在含有pJZ102的大腸桿菌細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的動態(tài)分析。將質(zhì)粒pJZ102和對照質(zhì)粒pJZ101在大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，直到細(xì)胞密度的Klett讀數(shù)達(dá)到80，此時，加入誘導(dǎo)劑、IPTG(最終濃度，10-3mol)，以激活從lac啟動子開始的轉(zhuǎn)錄，制備嵌合hhcM-lac52-KD蛋白質(zhì)。在特定時間取一毫升培養(yǎng)物樣品，通過離心沉淀，并使之溶解，然后在Laemmli緩沖液中煮沸使蛋白質(zhì)變性，取各種樣本等量的等分試樣，通過參考文獻(xiàn)中本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種在分離的細(xì)胞樣品中體外檢測肝細(xì)胞癌存在的方法，該方法包括：ａ）將來源于所述細(xì)胞樣品的核酸序列與一段包含圖１所示核苷酸７９至１４７９的核酸序列的核苷酸片段進(jìn)行接觸，所用的條件應(yīng)使得來源于細(xì)胞樣品的核酸序列和所述核苷酸片段能夠雜交，由此 形成一種復(fù)合物；ｂ）檢測所述復(fù)合物的存在。

【技術(shù)特征摘要】
...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊素，
申請(專利權(quán))人：美國政府由衛(wèi)生及人群服務(wù)部部長代表，
類型：發(fā)明
國別省市：US[美國]