作為凝集試劑的合成粒子制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及通過凝集作用檢測(cè)樣本液體中分析物的方法，其中將樣本液體與凝集試劑和惰性基質(zhì)接觸，反應(yīng)混合物受引力作用，測(cè)定分析物與凝集試劑之間的反應(yīng)；其中合成粒子被用作凝集試劑，選擇其直徑和密度使得它們對(duì)基質(zhì)的行為基本上與紅細(xì)胞的一樣。此外，公開了在其表面吸附有配體分子的新型合成粒子和這些粒子作為檢測(cè)試劑的應(yīng)用。（*該技術(shù)在2017年保護(hù)過期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及通過凝集作用檢測(cè)樣本液體中分析物的方法，其中將樣本液體與凝集試劑和惰性基質(zhì)接觸，反應(yīng)混合物受引力作用，測(cè)定分析物與凝集試劑之間的反應(yīng)。此外，公開了實(shí)施本專利技術(shù)的方法的新試劑。通過血凝反應(yīng)檢測(cè)分析物的方法和粒子凝集試驗(yàn)是已知的。首先用這些試驗(yàn)檢測(cè)抗原和抗體以診斷傳染病。然而，這些方法的共同缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而且結(jié)果通常是很難解釋。凝膠免疫分析法(其中通過惰性基質(zhì)中的離心步驟將凝集的血細(xì)胞與單獨(dú)的未凝集紅細(xì)胞分離(例如參照EP-A-0 194 212，EP-A-0 305 337，EP-A-0 557 546，EP-A-0 634 216，EP-A-0 485 228和WO95/31731))是已知的血凝反應(yīng)試驗(yàn)，其中未固定的紅細(xì)胞被用作凝集試劑。在這些方法中，已凝集的紅細(xì)胞保留于惰性基質(zhì)上或惰性基質(zhì)中，于是可明顯地與未反應(yīng)的單個(gè)紅細(xì)胞分離，后者可穿透基質(zhì)而沉入反應(yīng)容器底部。只是在EP-A-0 305 337(該申請(qǐng)享受1987年在先申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán))中闡述過合成粒子如膠乳或聚合的瓊脂糖也可用作凝集試劑。然而，它未報(bào)導(dǎo)這些合成粒子的性能。此外，該文獻(xiàn)在后來的專利或其它出版物中未被引用。反之，最近的出版物如EP-A-0 557 546強(qiáng)調(diào)用未固定的紅細(xì)胞作凝集試劑。但是，未固定紅細(xì)胞的缺點(diǎn)是它們?cè)谀承┓磻?yīng)條件下的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致溶血作用。該不穩(wěn)定性通常導(dǎo)致基于未固定紅細(xì)胞的產(chǎn)物過短終止期。此外，只能以相當(dāng)費(fèi)勞力的方式實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和重復(fù)性生產(chǎn)紅細(xì)胞制劑、尤其是抗體偶聯(lián)或抗原偶聯(lián)的紅細(xì)胞制劑。其實(shí)這就會(huì)使紅細(xì)胞制劑的物理性質(zhì)不能保持一致。因此，本專利技術(shù)的目的是至少部分地消除用紅細(xì)胞作凝集試劑引起的前述缺點(diǎn)。確切地說，本專利技術(shù)旨在提供可用作凝集試劑的合成粒子，且這種合成粒子能模擬紅細(xì)胞在已知的凝膠免疫分析中的行為。此外，該合成粒子應(yīng)允許單純偶聯(lián)生物物質(zhì)，并且應(yīng)設(shè)計(jì)成在敏感性和特異性方面至少相當(dāng)于以前用的紅細(xì)胞凝集試劑。將這些合成粒子用于凝集試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)可能比先前的已知方法更易于操作和評(píng)價(jià)。通過由凝集作用檢測(cè)樣本液體中分析物的方法來實(shí)現(xiàn)上述目的，其中將樣本液體與凝集試劑和惰性基質(zhì)接觸，反應(yīng)混合物受引力作用，測(cè)定分析物與凝集試劑之間的反應(yīng)，其特征在于，選擇用作凝集試劑的合成粒子的直徑和密度使其對(duì)基質(zhì)的行為基本上與紅細(xì)胞的一樣。意外地發(fā)現(xiàn)，如果密度和直徑控制得當(dāng)，則實(shí)際上可使生產(chǎn)的合成粒子易于穿透凝膠免疫分析中的惰性基質(zhì)，于是可完全模擬新鮮的紅細(xì)胞。在導(dǎo)致本專利技術(shù)的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)與紅細(xì)胞(直徑6-8μm)相比，剛性聚合物粒子的遷移大為延遲。在給定的標(biāo)準(zhǔn)條件下它尤其意味著直徑為3-7.5μm的可商購標(biāo)準(zhǔn)粒子在凝膠基質(zhì)中只是不完全地沉降，而更大(11.9μm)或更小(＜1μm)的合成粒子只稍能透入凝膠。盡管提高參數(shù)即延長離心時(shí)間(從10min增至50min)和加大離心速度(從1030至1300rpm)可改善沉降，但仍不完全。即使這兩項(xiàng)措施可達(dá)到最佳沉降，但基于下述原因改變/增大離心時(shí)間和速度相當(dāng)不利1.相對(duì)于類似的方法而言，本專利技術(shù)的系統(tǒng)尤其應(yīng)是不費(fèi)時(shí)的方法。所以可能的50min離心時(shí)間將會(huì)是包括保溫的20min預(yù)定時(shí)間的3倍。2.本領(lǐng)域中的技術(shù)人員熟知，提高離心速度會(huì)降低凝膠離心法的靈敏度。3.如果可遵循特定的參數(shù)，則本專利技術(shù)的系統(tǒng)可應(yīng)用商品化離心機(jī)。意外地發(fā)現(xiàn)，直徑小于紅細(xì)胞且密度高于通常值的合成粒子通過惰性基質(zhì)時(shí)的行為與紅細(xì)胞的相當(dāng)。在這一點(diǎn)上，有可能應(yīng)用球形和不對(duì)稱的合成粒子。業(yè)已證實(shí)平均直徑≤5μm且尤其是1～5μm的合成粒子優(yōu)選適于本專利技術(shù)的方法，而平均直徑為2～4μm是特別優(yōu)選的。粒子的相對(duì)密度優(yōu)選≥1.1g/cm3且最好是在1.1～1.8g/cm3范圍內(nèi)。特別地，如果是在標(biāo)準(zhǔn)條件如對(duì)于已知的商用紅細(xì)胞凝膠免疫分析規(guī)定的(例如DiaMed)條件下實(shí)施檢測(cè)方法，則相對(duì)密度優(yōu)選在1.1～1.6g/cm3范圍內(nèi)且最優(yōu)選在1.15～1.4g/cm3范圍內(nèi)。用作本專利技術(shù)方法中的凝集試劑的合成粒子優(yōu)選是有機(jī)聚合物或共聚物粒子。特別優(yōu)選的材料是苯乙烯和苯乙烯衍生物如溴苯乙烯、尤其是其共聚物。制備大小范圍一致的、適用作本專利技術(shù)的凝集試劑的聚合物粒子，可采用本領(lǐng)域中的技術(shù)人員相當(dāng)熟悉的方法(Arshady(1992)Suspension，emulsion and dispersion polymerizationA methodologicalSurvey.Colloid & Polymer Science 270，717-732；Okubo and Shiozaki(1992)Production of micron-size monodisperse polymer particles byseeded polymerization utilizing dynamic swelling method with coolingprocess.Polymer International 30，469-474)。這些方法通常是將乳液聚合和分散聚合相結(jié)合以生產(chǎn)具有嚴(yán)格規(guī)定的物理性能的粒子。至于目視檢測(cè)本專利技術(shù)方法中的凝集反應(yīng)，可于粒子中摻入染料尤其是水不溶性染料。于是，染成藍(lán)色、黃色、綠色、黑色或紅色的合成粒子已證實(shí)特別適合于目視估測(cè)。在本專利技術(shù)的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，由于其特別好的可檢測(cè)性而應(yīng)用紅色粒子。合成粒子的強(qiáng)度使之能通過已知的標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)方法將大量不同的配體固定于其表面。在該技術(shù)中最好是固定可與待測(cè)分析物結(jié)合的配體分子。配體分子可通過吸附性、共價(jià)鍵或高親和力相互作用來固定。共價(jià)偶聯(lián)例如可通過表面露出的化學(xué)活性基團(tuán)而實(shí)現(xiàn)，這類基團(tuán)的實(shí)例有羧基、氨基、醛基和環(huán)氧基。借助高親和作用的固定化可由高親和力結(jié)合對(duì)的兩個(gè)配對(duì)物如抗生蛋白鏈菌素或阿維丁/生物素、半抗原/抗體、糖類/凝集素等介導(dǎo)。這些共價(jià)作用和高親和作用使之能固定配體分子如肽類例如合成制備的肽，蛋白質(zhì)例如糖蛋白、脂蛋白、重組多肽，免疫球蛋白，核酸例如DNA或RNA、核酸類似物，糖類例如單糖、二糖、寡糖和多糖，脂質(zhì)，激素，代謝物或其它生物物質(zhì)。在這方面，可直接完成固定化，或者利用聯(lián)接基以可控方式實(shí)現(xiàn)結(jié)合配體分子的優(yōu)選最適取向。不過，也可以通過純粹的吸附方法固定配體分子，這對(duì)于例如下列物質(zhì)而言是可能的細(xì)胞膜如紅細(xì)胞、血小板或白細(xì)胞的膜，細(xì)胞膜碎片，或者細(xì)胞或病原體如病毒、細(xì)菌或寄生蟲的裂解物。如果應(yīng)用染色的合成粒子，就沒必要另外將膜染色。本專利技術(shù)的方法涉及檢測(cè)樣本液體中的分析物。體液優(yōu)選用作樣本液體，它可任意稀釋，例如血液、血清、血漿、唾液或尿。用于本專利技術(shù)方法的樣本液體體積可變范圍寬，1～200μl的體積優(yōu)選用于微量試驗(yàn)。所述合成粒子被用作本專利技術(shù)方法中的凝集試劑，這些粒子的表面優(yōu)選含有能與分析物以高親和力結(jié)合的特定配體分子。該凝集試劑通常含數(shù)個(gè)結(jié)合分析物的位點(diǎn)，使之形成包括分析物與凝集試劑的交聯(lián)凝集復(fù)合體。可用本專利技術(shù)方法檢測(cè)的分析物是能與凝集試劑進(jìn)行專一作用和具有高親和性的物質(zhì)例如可由免疫反應(yīng)測(cè)定的抗原和抗體，也可以是可由雜交反應(yīng)測(cè)定的核酸。本專利技術(shù)第一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及檢測(cè)用作樣本液體中分析物的抗體，例如抗病原體如病毒(HIV、肝炎病毒)、細(xì)菌或原生動(dòng)物的抗體本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
通過凝集作用檢測(cè)樣本液體中分析物的方法，其中將樣本液體與凝集試劑和惰性基質(zhì)接觸，反應(yīng)混合物受引力作用，測(cè)定分析物與凝集試劑之間的反應(yīng)， 其中 將合成粒子用作凝集試劑，選擇其直徑和密度使得它們對(duì)基質(zhì)的行為基本上與紅細(xì)胞的一樣。

【技術(shù)特征摘要】
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：P施維德，D巴什福思，RN霍比斯，G馬吉茨，MJ馬歇爾，MJJ羅伯特，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：診斷研究基金會(huì)，
類型：發(fā)明
國別省市：CH[瑞士]