一種用變色酸衍生物比色測定血清鎂的方法技術

一種比色法測定血清鎂的方法。原有的比色測定血清鎂的方法是Ｃａｌｍａｇｉｔｅ法和ＭＴＢ法，但測度分辨力低，精度較差。本發明專利技術方法采用２－（８’－羥基喹啉－５’－磺酸－７’－偶氨）－變色酸（８Ｑ↓［５］ＳＡＣ）作為金屬離子粘合劑，在堿性緩沖介質中與血清鎂絡合呈色，以聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）和ＯＰ乳化劑作抗蛋白干擾劑和反應增色劑，波長５４１ｎｍ處有一主吸收峰，以ＥＧＴＡ掩蔽血清鈣，反應液吸光度與鎂濃度０－３ｍｍｏｌ／Ｌ范圍內成正比。本發明專利技術方法簡便、微量、快速、準確、穩定，本方法靈敏度、試劑穩定性明顯優于Ｃａｌｍａｇｉｔｅ法和ＭＴＢ法，適用于血清鎂的常規手工分析和生化分析儀分析。（*該技術在2016年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于血清鎂比色法測定
血清鎂的測定方法有原子吸收分光光度法、酶偶聯速率測定法和比色法等。原子吸收分光光度法是鎂測定的參考方法，因儀器條件限制難以普及。酶偶聯法國外文獻有過報導，國內未見應用。基于金屬絡合劑顯色的比色法操作簡便，反應迅速，其中的Calmagite法和甲基百里酚藍法(MTB)被廣泛采用。但上述兩種比色法的靈敏度、MTB法的試劑及反應液穩定性不甚理想。本專利技術的目的是提供一種使用國內新合成的金屬離子絡合劑2--(8′-羥基喹啉-5′-磺酸-7′-偶氮)-變色酸(8Q5SAC)進行血清鎂測定的方法。本專利技術方法簡便、微量、快速、準確、穩定，本方法靈敏度、試劑穩定性明顯優于Calmagite法和MTB法，適用于血清鎂的常規手工分析和生化分析儀分析。本測定方法的實施原理8Q5SAC在堿性緩沖介質中與血清鎂絡合呈色，波長541nm處有一主吸收峰。以乙二醇雙(α-氨基乙基)醚四乙酸(EGTA)掩蔽血清鈣。反應液吸光度與鎂濃度在一定范圍內成正比。材料與方法一、試劑1、緩沖液每升含甘氨酸0.1mol、NaOH 0.13mol、NaCl 0.2mol，EGTA0.2mmol NaN315mmol。2、顯色劑每升含8Q5SAC(南昌大學合成)0.3mmol，聚乙烯吡咯烷酮5g，op乳化劑6ml3、10mmol/L鎂標準液4、鎂標準應用液(1.0mmol/L)5、應用試劑試劑1、2等量混合。室溫密閉遮光保存，穩定期至少兩周。二、儀器1、722型分光光度計2、pH計三、方法在測定、標準、空白管中分別加人血清、鎂標準應用液(1mmol/L)、水各0.02ml，每管加應用試劑3ml。混勻。靜置2分鐘。540nm波長，1cm光徑，空白管調零比色。計算血清鎂(mmol/L)＝(測定A/標準A)×1式中測定A測定管吸光度；標準A標準管吸光度；1鎂標準應用液濃度1mmol/L實驗結果一、吸收光譜以應用試劑調零，鎂反應液的吸收光譜(附圖說明圖1)在541nm和575nm處有兩個吸收峰，541nm為主峰。以水調零，應用試劑的吸光度從480nm-600nm為一上升坡形，541nm處空白吸光度明顯低于575nm處吸光度。所以，選擇540nm為測試波長。二、緩沖體系及pH的選擇分別配制以甘氨酸-NaOH和硼酸鹽為緩沖體系的系列pH應用試劑與鎂反應。以對應管試劑空白調零，讀取各管吸光度，圖2。其靈敏度甘氨酸-NaOH緩沖體系在pH11.2時最高，硼酸鹽緩沖體系在pH9.8時最高，前者的靈敏度大大高于后者。以pH11.2，終濃度25-75mmol/L的甘氨酸緩沖體系應用試劑測鎂，甘氨酸濃度為50mmol/L時靈敏度最佳。選擇應用試劑緩沖體系為甘氨酸-NaOH，pH11.2，甘氨酸終濃度為50mmol/L。三、8Q5SAC濃度選擇試劑空白吸光度與8Q5SAC濃度成正比，測試靈敏度與8Q5SAC濃度在一定范圍內正相關，圖3，8Q5SAC濃度達0.15mmol/L以上時，靈敏度不再上升。兼顧空白吸光度和靈敏度，選擇應用試劑中8Q5SAC終濃度0.15mmol/L。四、EGTA濃度選擇8Q5SAC法測定血清鎂的最大干擾源是鈣。EGTA在pH11.2的反應介質中對鈣的選擇性明顯大于鎂。配制含系列EGTA濃度(50-150umol/L)的應用試劑，觀察鎂靈敏度和鈣掩蔽作用。各濃度管的鎂靈敏度基本一致，EGTA濃度達75umol/L，可掩蔽樣品鈣濃度達8mmol/L。選擇EGTA終濃度為100umol/L五、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和OP乳化劑濃度選擇聚乙烯吡咯烷酮可防止蛋白質干擾反應，降低空白吸光度，提高測試靈敏度，并改變反應液吸收光譜(吸收峰由523nm、560mm移至541mm和575mm)。經試驗聚乙烯吡咯烷酮終濃度為2.5g/L時，反應靈敏度最高。OP乳化劑可防止蛋白質對反應的干擾，降低空白吸光度，提高反應靈敏度。OP乳化劑終濃度為3ml/L時，靈敏度最高。六、干擾試驗下列物質含量鈉1.2mol/L，鉀80mmol/L，鈣10mmol/L，高鐵離子300umol/L，亞鐵離子50umol/L，銅50umol/L，鋅50umol/L，血紅蛋白10g/L，總膽紅素386umol/L，對本法均無有意義的干擾。七，回收試驗鎂濃度0.86mmol/L的混合血清1ml，分別加入10mmol/L鎂標準液50、80、100ul，測得值分別為1.28，1.50，1.66mmol/L。回收率依次為98.8％，97.6％、98.2％，平均回收率98.2％。八、線性試驗可接受的線性范圍0-3mmol/L。圖4。九、重復性試驗n x s cv％低值 批內200.86 0.023 2.67批間100.87 0.026 2.99高值 批內201.51 0.029 1.92批間101.53 0.039 2.55十 對照試驗26份樣品鎂濃度0.63-1.86mmol/L本法(X)與Calmagite法(Y，TRACE試劑，批號60535)平行測定，r＝0.996Y^=0.948X^+0.041,]]>t＝1.163，P＞0.2。本法(X)與MTB法(Z，科華試劑，批號960811)平行測定，r＝0.983Z^=1.260X^-0.232,]]>t＝1.082，P＞0.2。三種方法平行測定1mmol/L鎂標準液(方法標準液0.05ml，試劑7.5ml混勻5分鐘，1cm光徑，水調零比色)結果見下表 本法與Calmagite法空白吸光度(A空白)基本一致。靈敏度是Calmagite法的2.5倍，是MTB法的4.3倍。十一、顯色時間及穩定性即刻顯色，顯色穩定時間2分鐘至l5小時。十二、正常參考值測定65例正常成人血清鎂，x=0.89mmol/L，s＝0.11，x±1.96s為0.67-1.11mmol/L。本專利技術確定的用8Q5SAC進行血清鎂比色測定方法，實驗結果證明該法簡便、微量、快速，準確性、重復性、線性和抗干擾能力等各項指標均達到滿意效果。本法完全可以用于血清鎂的常規分析。本方法的優點是設計利用8Q5SAC的靈敏特性，研究優化反應條件，使測鎂靈敏度明顯高于目前常用的MTB法和Calmagite法，分別高4.3倍和2.5倍，從而使得血清鎂比色法測試分辨力低，精度較差的問題有較大改變。本方法的另一優點是所用試劑穩定。雙試劑可長期貯存，應用試劑的穩定性(可達兩周)也優于Calmagite法(4天)和MTB法(5小時)。因此本法不僅能使手工操作更加簡便，而且通過適當編排即能運用于具有雙試劑功能的生化分析儀，也能方便地運用于單試劑功能的生化分析儀。本方法的再一優點是主要試劑材料8Q5SAC由國內合成，而且方法性能優于依靠進口試劑的Calmagite法。權利要求1.一種比色測定血清鎂的方法，本專利技術的特征是以2-(8′-羥基喹啉-5′-磺酸-7′-偶氮)-變色酸(8Q5SAC)作為金屬離子絡合劑，在堿性緩沖介質中與血清鎂絡合呈色，以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和OP乳化劑作抗蛋白干擾劑和反應增色劑，在波長541nm處有一主吸收峰，以乙二醇雙(α-氨基乙基)醚四乙酸(EGTA)掩蔽血清鈣，反應液吸光度與鎂濃度本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種比色測定血清鎂的方法，本專利技術的特征是以２－（８′－羥基喹啉－５′－磺酸－７′－偶氮）－變色酸（８Ｑ５ＳＡＣ）作為金屬離子絡合劑，在堿性緩沖介質中與血清鎂絡合呈色，以聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）和ＯＰ乳化劑作抗蛋白干擾劑和反應增色劑，在波長５４１ｎｍ處有一主吸收峰，以乙二醇雙（α－氨基乙基）醚四乙酸（ＥＧＴＡ）掩蔽血清鈣，反應液吸光度與鎂濃度在０－３ｍｍｏｌ／Ｌ范圍內成正比。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳力平，黃雅娟，周雪，胡康林，田云，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第一零一醫院，
類型：發明
國別省市：32[中國|江蘇]