采用湍流冷卻氣流控制凝膠電泳期間的溫度梯度制造技術

一種凝膠電泳分離裝置，包括下述部件之結合；氣體熱交換介質、氣體熱交換介質驅動設備、和沖擊設備。由此，氣體熱交換介質驅動設備驅使氣體熱交換介質穿過沖擊設備，提供氣體熱交換介質在凝膠板表面上流動。從而，由氣體熱交換介質穿過沖擊設備流通誘導的氣流，借助強制對流作用，將凝膠中的溫度梯度降至最小。（*該技術在2015年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及進行DNA測序時，采用板式凝膠電泳對單鏈DNA片段的分離。具體說來，本專利技術涉及借助板式凝膠電泳進行DNA順序分析的裝置，該裝置包括一種以湍流氣體熱交換介質沖擊為基礎的溫度控制部件。本專利技術突擊特點是，電泳期間凝膠分離介質中產生的熱溫度梯度降至最小。因此，使用本專利技術裝置，將改善DNA順序分析的速度，可靠性及清晰度。凝膠電泳是一項基本生化分離技術，它成為根據分子大小、電荷或二者結合，來區分各種生物學重要分子之基礎。采用凝膠電泳能很好分離的生物分子的具體例包括蛋白質和核酸。電泳通常在含有電導緩沖液的膠狀物(如瓊脂糖)或高聚物(如聚丙烯酰胺)介質(一般稱為“凝膠”)中進行。借助穿過凝膠截面的化學惰性金屬電極施加電壓，方進行電泳。所要研究的生物樣品，置于該凝膠中預先形成的樣品井中(sample well)，該井通常位于凝膠一端，所施加電壓的極性要使得該生物樣品通過凝膠朝電極之一泳動(遷移)(通常指位于與樣品相對的凝膠一端之電極)。假如適宜，可通過加入化學改性劑(如脲、甲酰胺、或十二烷基硫酸鈉)至凝膠，以及電泳緩沖液，來維持泳動距離和分子大小之間的反線性關系。凝膠電泳的特殊應用，是測定所研究核酸的核苷酸順序時，分離單鏈DNA片段。為此目的，要匯集經核酸化學降解產生(使用Gilbert法，例如見Maxam和Gilbea(1980)，Methods Enzyme，65，P499-500)，或使用聚合酶進行替換DNA合成產生(采用Sanger法，例如見Sanger，F.，Niklen，S.，和Coulson，A.R.(1977)，Proc.Nat.Acad.Sci.USA74，P5463-5467)的單鏈DNA片段。所匯集的單鏈DNA片段，包括與欲測定順序中各位置相對應的片段，在最頻繁使用的測序法中，此種對應直接關系到退火的引物中聚合反應引發固定位點至欲測序核酸之距離。因而，所需順序的測定取決于各片段的分離，這些片段的長度差別只有一個核苷酸。對各位置各自可能的核苷酸的鑒別(腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷)，傳統方法是，在單獨的化學反應混合物中，進行對各末端核甘酸具特異性的測序反應來加以區分。這樣，一般在4個分開的試管中進行各個測序實驗，在這些試管中，形成各末端處于與該反應所利用的末端核苷酸相對應位置處的各種片段之匯集。然后，將一組4種反應物各自進行改性(dena turing)凝膠電泳測定核苷酸順序，每種反應物在單一測序凝膠的相鄰泳道中獨自電泳。該凝膠的某核苷酸特異泳道中某位置上存在的譜帶，便表明鑒定出所測順序中，該位置上有此種核苷酸。使用常規技術，將各片段進行放射性標記，電泳之后，借助放射自顯影法可使這些譜帶顯現出來。此外，最近的技術改進開發出自動測序機。此種機器在與載樣井相對的凝膠末端裝有分光光度檢測裝置。使用熒光標記引物，或熒光標記核苷酸合成DNA片段。在每種情況下，各核苷酸反應分別連續進行，其中用有區別的熒光標記物來對相應于各核苷酸的片段進行熒光標記。然而，因為每種熒光標記物表現出特性頻率的熒光發射作用，因此可從其熒光發射信號來區分各片段末端位置所要鑒定的核苷酸。該特征使得可以用該裝置借助分光光度法自動化匯集核苷酸順序資料。另外，各片段存在不同熒光信號，也使得四種分開的定順反應產物可在凝膠的單一泳道進行電泳。這些技術的開發，提高了對核苷酸測序反應中產生的測序片段精確和可靠分離之要求。然而，就該
現狀來說，現有板式凝膠電泳技術存在許多尚未解決的固有技術局限性。例如，由于對區分分離片段范圍的局限性，迫使各測序反應物系列加樣于凝膠上時要分兩次加于兩組泳道中。第一次加樣的泳道(由此電泳最長)用于測定距聚合反應引發位最遠的核苷酸順序(因而是最長的片段)，而第二次加樣的一組被理解為測定最靠近引發位的核苷酸順序。加樣的相對時間安排和允許反應物的電泳時間靠經驗選擇，以使這些范圍相符(overlap)，這樣，便可以看到任何特定核苷酸順序的一個完整部份。該電泳的這些局限性的結果是，可從給定位點引發的測序反應，看到最多350-400堿基。因此，若開發能分辨比目前可能的長度較長之核苷酸順序的方法和裝置，將是對該領域有益的促進。對使用常規電泳技術能獲得核苷酸順序資料之程度的許多其它技術局限性，在于使用板式凝膠電泳分析DNA順序所需電泳條件造成的。其中最為顯著仍是電泳期間凝膠中所產生的熱溫度梯度。為了按各片段長度比例以電泳分離開單鏈DNA片段，一般在凝膠兩端施加1000-3000伏電勢2-16小時。有大約30-60瓦能量在凝膠中作為熱均勻消耗掉，然后從含板式凝膠的凝膠板表面消散。此種熱是有用的(實際上是必需的)，因為它促使單鏈DNA處于變性狀態(以使泳動距離與片段長度成反比)。但是此種生熱程度限制于包括電泳設備在內的材料耐熱度。這種限制限制了所施加電壓的最高幅度，因為電泳持續時間取決于所加電壓的幅度，縮短電泳時間的能力也受到所加能量幅度的制約。伴隨DNA測序凝膠生熱的另一問題是該熱在整個凝膠中分布不均衡，結果凝膠中產生熱溫度梯度。在常規改性丙烯酰胺凝膠條件下，電泳期間，該凝膠中心1/4-1/3之處要比全長其余部份熱。因為單鏈DNA片段的流動性隨溫度按比例改變(每℃提高約2.2％比例)，不均衡加熱造成中心泳道的樣品比邊緣樣品泳動快。該結果使得其泳道譜帶圖形橫穿凝膠呈現“微笑”狀的測序凝膠從凝膠中心朝邊緣，該譜帶逐漸偏向陽極(采用常規技術即朝上)。另一現有技術尚未解決的嚴重問題是與高電壓板式凝膠電泳相關的問題-產生前后熱溫度梯度。特別是測序凝膠各泳道中每條譜帶與所有其它譜帶的分辨率受這些類型熱梯度的影響。譜帶分辨率取決于每條帶的尺寸(即厚度)，以及各帶平均厚度和分隔各帶的空間寬度之間的關系。由厚帶組成的測序階梯平均比較薄凝膠(即拆分帶更緊者)，含較少可分辨帶，只是由于該凝膠拆分帶長度有限的緣故。同時，因為原則上測序凝膠中各帶小至一個核苷酸均可分開，那么具多重特定核苷酸(如5＇-TTTTTTTTT-3＇)的DNA展開后，在較厚凝膠(拆分帶欠緊密)中，比在較薄凝膠(拆分帶較緊密)中分辨更為困難。雖然該因素對于拆分一種核苷酸重復展開的鏈特別重要(因為在同一泳道中進行的相應于這些核苷酸每一種的單鏈DNA片段電泳，該現象更為嚴重)，但此種與帶寬相關的譜帶分辨率問題，也出現在跨越一條以上凝膠泳道的某些凝膠部份(稱之為“凝縮區”(compression zone))。這些問題已由現有技術正視，正如采用-標記的脫氧核苷酸標記測序反應中的DNA所證實的一樣(見Sambrook等人，出處同上)。因為35S發射較低能量粒子在放射自顯影膜較窄面轉換銀顆粒，所以由來自35S的β-粒子發射產生的放射自顯影帶帶寬，要比32P β-粒子發射產生的帶寬窄些。此種窄帶的有用性，盡管伴隨35S使用會面臨很多實際缺點，而其仍是該領域一種可接受的方法而得到證實(這些缺點包括較長的放射自顯影時間)。使用高電壓板式凝膠電泳分離的單鏈DNA片段帶寬的主要決定因素是高壓電泳期間該凝膠中產生的前后熱溫度梯度。因此，在DNA測序/凝膠電泳領域，在前后以及左右熱溫度梯度降至最小的條件下進行高電壓板式凝膠電泳所用設備，仍有未盡人意及不能滿足需要之處。因此，現有技術本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種凝膠電泳分離裝置，包括下述組合：氣體熱交換介質，氣體熱交換介質驅動設備，和沖擊設備，由此，氣體熱交換介質驅動設備驅使氣體熱交換介質穿過沖擊設備，以在凝膠板表面提供氣體熱交換介質流，從而，借助穿過沖擊設備的氣體熱交換介質的流通而產生的該氣流，通過強制對流方式，將凝膠中的溫度梯度降至最小。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：道格拉斯H史密斯，布賴恩J米夫薩德，迪安S伯吉，托馬斯E戴維斯，史蒂文M馮哈伊斯蒂，
申請(專利權)人：杰諾米克斯公司，
類型：發明
國別省市：US[美國]